Ο ρόλος του γονιδίου του JunB στη λεμφωματογένεση και η μελέτη των καθοδικών τελεστών του

Abstract

The anaplastic large cell lymphoma (ALCL) is an aggressive non-Hodgkin lymphoma of T-cell origin. It constitutes a separate category and according to the recent classification of the World Health Organization (WHO) it is divided in two distinctive entities the ALK+ and the ALK- ALCL, with significant differences at genetic and clinical level. The ALK+ ALCL, by definition, is accompanied by the presence of the oncoprotein Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK), which is expressed due to chromosomal rearrangements, the most common being the t(2;5)(p23;q35) translocation that leads to the formation of the chimeric oncoprotein NPM-ALK. Many oncogenic pathways are activated by NPM-ALK including ras, PLC-gamma, Jak/STAT, PI3k/AKT/mTOR, JNK/cJun. The ALK+ cells of ALCL present high activity of the activator protein-1 (AP-1) and overexpress two members of the family, cJun and JunB. The aim of this study was to identify the role of JunB in the lymphomagenesis of ALCL and explore the impact of the microenvironment on the development and dissemination of the disease. Experiments of transient silencing of the expression of JunB of the ALK+ ALCL cell lines led to cell cycle arrest, as the cells could not enter from the G1 to the S phase. Moreover, silencing JunB caused the decrease of the levels of the cyclins Α (CCNA2), D2 (CCND2) and D3 (CCND3). Then, the exosomes of the ALK+ and ALK- ALCL cell lines were isolated and characterized. Interestingly, JunB and other members of the AP-1 family were found in the protein cargo of the ALCL-derived exosomes, which consists proteins of the oncogenic signaling pathways, such as NPM-ALK, Akt, STAT3, ERK, proteins that participate in the activated oncogenic pathways of ALCL. Afterwards, the capability of the bone marrow fibroblasts and pro-B cells to uptake the ALCL-derived exosomes, was determined. In both cases, there was time dependent increase of the exosomal internalization. The pro-B cells, which need the supplementation of interleukin 3 in the growth medium, recorded increased growth rates when interleukin 3 was substituted by the ALCL-derived exosomes. The bone marrow fibroblasts, when educated with the ALCL exosomes, demonstrated morphological changes and altered cytokine expression profile, suggesting differentiation and transformation to cancer associated fibroblasts. With the use of a mouse model the changes of the cytokine expression profile were confirmed. Overall, the findings illustrated the vital role of the overexpression of JunB for the normal function of the cell cycle of the ALCL cells and for the first time the exosomes of the ALCL cell lines were isolated, characterized and tested for their abilities to impact the stroma cells. These findings will contribute on the understanding of the disease pathogenesis and dissemination.

Το αναπλαστικό λέμφωμα με μεγάλα κύτταρα (ΑΛΜΚ) είναι ένα επιθετικό μη-Hodgkin λέμφωμα, που προέρχεται από τα Τ κύτταρα. Αποτελεί μια κατηγορία λεμφώματος και σύμφωνα με την τελευταία ταξινόμηση του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ) διαχωρίζεται σε δύο διακριτές οντότητες, το ALK+ ΑΛΜΚ και το ALK- ΑΛΜΚ, με σημαντικές διαφορές σε γενετικό και κλινικό επίπεδο. Το ALK+ ΑΛΜΚ εξ’ ορισμού συνοδεύεται από την παρουσία της ογκοπρωτεΐνης Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) η έκφραση της οποίας οφείλεται σε χρωμοσωμικές ανακατατάξεις, με την πιο συχνή να είναι η μετάθεση t(2;5)(p23;q35) που οδηγεί στη δημιουργία της ογκοπρωτεΐνης NPM-ALK. Η NPM-ALK είναι ικανή να ενεργοποιήσει πολλαπλά ογκογενετικά μονοπάτια συμπεριλαμβανομένων των ras, PLC-gamma, Jak/STAT, PI3k/AKT/mTOR, JNK/cJun. Τα κύτταρα του ALK+ ΑΛΜΚ δείχνουν υψηλή ενεργότητα της activator protein-1 (AP-1) και υπερεκφράζουν δύο μέλη της οικογένειας AP-1, τα cJun και JunB. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση του ρόλου του JunB στη λεμφωματογένεση του ΑΛΜΚ και η μελέτη του ρόλου του μικροπεριβάλλοντος στην ανάπτυξη και εξάπλωση της νόσου. Με πειράματα παροδικής σίγασης της έκφρασης του JunB σε κυτταρικές σειρές του ALK+ ΑΛΜΚ διαπιστώθηκε η απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, καθώς παρεμποδίστηκε η μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S. Επίσης, η αποσιώπηση του JunB οδήγησε στη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων και τη μείωση των επιπέδων των κυκλινών Α (CCNA2), D2 (CCND2) και D3 (CCND3). Έπειτα, απομονώθηκαν τα εξωσώματα των κυτταρικών σειρών του ALK+ και ALK- ΑΛΜΚ και ακολούθησε ο χαρακτηρισμός τους. Καταγράφηκε το μέγεθος και ο πληθυσμός τους ενώ εξετάστηκε και το πρωτεϊνικό τους περιεχόμενο. Παρατηρήθηκε η παρουσία του JunB και άλλων μελών της οικογένειας AP-1 αλλά και σημαντικών πρωτεϊνών που συμμετέχουν στα σηματοδοτικά μονοπάτια που χαρακτηρίζουν το ΑΛΜΚ όπως οι: NPM-ALK, Akt, STAT3, ERK. Ακολούθως, εξετάστηκε η ικανότητα πρόσληψης των εξωσωμάτων από τα κύτταρα των ινοβλαστών του μυελού των οστών και τα προ-Β κύτταρα. Και στις δύο περιπτώσεις καταγράφηκε αυξημένη ικανότητα πρόσληψης ανάλογη με το χρόνο. Κατόπιν, εξετάστηκε η επίδραση των εξωσωμάτων του ΑΛΜΚ στα κύτταρα του στρώματος. Τα προ-Β κύτταρα, τα οποία εξαρτώνται από την παρουσία της ιντερλευκίνης 3 για την ανάπτυξή τους, επέδειξαν αυξημένο ρυθμό ανάπτυξης όταν αντικαταστάθηκε η ιντερλευκίνη 3 με τα εξωσώματα του ΑΛΜΚ. Οι ινοβλάστες του μυελού των οστών, μετά την προσθήκη των εξωσωμάτων παρουσίασαν σημάδια διαφοροποίησης σε καρκινικά σχετιζόμενους ινοβλάστες. Διαφοροποιήθηκε η μορφολογία τους και άλλαξε το προφίλ των εκκρινόμενων κυτταροκινών στο θρεπτικό τους μέσο. Η αλλαγή στο προφίλ των εκκρινόμενων κυτταροκινών επιβεβαιώθηκε σε μοντέλο πειραματόζωων (ποντικού). Συνολικά, τα ευρήματα που παρουσιάστηκαν κατέδειξαν τη σημασία της υπερέκφρασης του JunB για την απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων του ΑΛΜΚ, αλλά και για πρώτη φορά χαρακτηρίστηκαν τα εξωσώματα των κυτταρικών σειρών του ΑΛΜΚ και μελετήθηκε η επίδρασή τους στα κύτταρα του στρώματος. Τα ευρήματα της μελέτης συμβάλλουν στην κατανόηση των μηχανισμών παθογένειας και διασποράς της νόσου.