Μοριακή μελέτη της γενετικής αστάθειας μικροδορυφορικού DNA σε καρκίνο μαστού: συσχέτιση με την ανοσοϊστοχημική έκφραση και τις μεταλλάξεις του p53

Abstract

Introduction-Purpose: It is now well accepted that genetic abnormalities, mainly mutations of oncogenes, onco-suppressor genes and repair genes, are crucial for cancer development and progression. The main goal of this study is to investigate the potential role of two biological parameters, microsatellite instability and p53 onco-suppressor gene mutations and expression, in breast cancer. Microsatellites are short tandem repeat DNA sequences, comprising multiple copies of a repeat unit of 1-13 base pairs. They are common, highly polymorphic and distributed widely throughout the genome. Recently, instability of these repeats (i.e. variations in the number of repetitive unit sequences) has been reported in a variety of cancers, but not in adjacent normal tissues from the same individual. It is also assumed that loss of DNA mismatch repair enzymes (MMR) may be involved. In this study, we investigated if there is evidence of Microsatellite Instability (MSI) or/and MMR deficiency in cancerous and adjacent normal breast tissues, with a set of 4 microsatellite markers. Alterations of the p53 tumor suppressor gene are probably the most common genetic abnormalities in human malignancies, including breast cancer. The majority of p53 mutations occur in the conserved DNA-binding domain (exons 5-8) and may lead to loss of DNA binding that is believed to be critical for the biological activity of p53. In breast cancer, frequency of p53 mutation is reported about 20%, lower than in other solid tumors. The implications for breast carcinogenesis however are unclear; in several studies it has been associated with more aggressive disease and worse overall survival. In our study we aimed to detect the presence of gene mutations in exons 5-8 and protein accumulation of p53 tumor-suppressor gene in breast carcinomas. Methods: DNA was extracted from 60 breast carcinomas of various histopathology and corresponding adjacent normal tissues. We investigated 4 highly informative and polymorphic microsatellite loci (D17S807, D16S301 D16S305 and GH) on chromosomes 17, 16q22.1, 16q24.3 and 17q22-24 respectively, with radiolabeled PCR and autoradiography. We also studied immunohistochemical expression of MMR proteins MSH2 and MLH1. In the second phase, we used a PCR and GC-clamped DGGE assay, followed by sequencing, to investigate the presence of mutations within exons 5-8 of p53 gene. Additionally, we looked for p53 protein accumulation by immunostaining (IHC). Results: We did not detected evidence of microsatellite instability for the particular microsatellite markers. Also, MSH2 and MLH1 proteins retained their nuclear expression, in all cases analyzed. About 20% of the cases seemed to be carriers a p53 aberration (7 in exon6, 2 in exon7, 2 in exon8 and 1 in exon5). The vast majority of mutations were documented in invasive ductal type – high grade tumors. In all (but one) cases that produced a variant DGGE-pattern, gene alterations were identified by sequencing. Of these, two mutations: a missense at g.13418T>A (p.Y220N) and a deletion at g.13270delG have not been previously reported in breast cancer. The presence of mutations revealed a strong correlation with high-grade breast carcinomas (p=0.002). Positive immunostaining of p53 protein was observed more frequently in invasive breast carcinomas (51%) than in in situ component (27%), with statistical significance (p=0.043). P53 overexpression was associated with the presence of mutations in p53 gene (p=0.004). Conclusions: Our findings, in agreement with other reports, indicate that genetic events involving microsatellite instability and MMR protein deficiency, which are crucial in colorectal and other tumors, are uncommon and do not play an important role in breast cancer. Due to the difficult comparison and evaluation of the results of different studies, further analyses on large series of breast specimens using more informative markers, should shed light on this issue. Regarding our results on p53, PCR-DGGE assay is an efficient and highly sensitive prescreening approach of p53 mutation detection in DNA samples of breast cancer patients. The combination of molecular techniques (DNA sequencing) and immunohistochemistry should be considered the “golden standard” for the detection of p53 abnormalities and confirm how a mutation could affect protein expression. The presence of mutations and p53 protein accumulation in invasive carcinomas, as well as the significant correlation between mutations and high tumor grade, reveal their possible implication in advanced stages of breast carcinogenesis.

Εισαγωγή-Σκοπός: Η ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου έχει συσχετισθεί με αρκετές γενετικές ανωμαλίες. Κυριότερες αυτών είναι οι μεταλλάξεις ογκογονιδίων και ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε συνδυασμό με μεταλλάξεις και σε άλλα ειδικά γονίδια όπως τα επιδιορθωτικά. Βασικός στόχος της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση και πιθανή συμβολή των βιολογικών φαινομένων της μικροδορυφορικής αστάθειας ή/και βλάβης των επιδιορθωτικών πρωτεϊνών του συμπλέγματος MMR, καθώς και των μεταλλάξεων και της έκφρασης του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53, σε σποραδικούς καρκίνους του μαστού. Οι μικροδορυφόροι (microsatellites) είναι περιοχές του DNA αποτελούμενες από συνεχείς επαναλήψεις ενός «μοτίβου» μικρού αριθμού (1-10) νουκλεοτιδίων. Είναι συχνές, πολυμορφικές και διάσπαρτες εντός του γενώματος. Πρόσφατα, ένας νέος τύπος γενετικής αλλαγής, η μικροδορυφορική αστάθεια DNA (MSI - Μicrosatellite Instability) (δηλ. μεταβολή των επαναληπτικών αλληλουχιών στο DNA του καρκινικού ιστού συγκρινόμενο με το φυσιολογικό DNA) έχει αναφερθεί σε ποικίλους καρκίνους, και έχει συσχετισθεί με ελαττωματικό επιδιορθωτικό σύστημα ενζύμων MMR (επιδιόρθωσης παράταιρων βάσεων). Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε εάν υπάρχουν στοιχεία MSI ή/και ανεπάρκειας των πρωτεϊνών MMR, σε καρκινώματα μαστού. Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 φέρεται να είναι το πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο στον ανθρώπινο καρκίνο. Η πλειονότητα των μεταλλάξεων εντοπίζονται στη συντηρημένη περιοχή δέσμευσης του γονιδίου με το DNA (εξόνια 5-8) και μπορεί να οδηγήσουν σε απώλεια δέσμευσης στο DNA, γεγονός κρίσιμο για τη βιολογική δράση της Ρ53-πρωτεΐνης. Στον καρκίνο του μαστού η συχνότητα μεταλλάξεων αναφέρεται περίπου 20%, χαμηλότερη σε σχέση με άλλους συμπαγείς όγκους. Ωστόσο η ανίχνευση μεταλλάξεων στην αλληλουχία του γονιδίου αποτελεί αντικείμενο έρευνας με συνεχώς αυξανόμενο ενδιαφέρον, καθώς η εμπλοκή του στην καρκινογένεση του μαστού δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η ανίχνευση μεταλλάξεων στα εξόνια 5-8 του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 καθώς και έλεγχος της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης της πρωτεΐνης, σε καρκινώματα μαστού διαφορετικών ιστολογικών τύπων. Μεθοδολογία: Εξετάσθηκαν συνολικά 60 δείγματα από πρωτοπαθή καρκινώματα μαστού ποικίλης ιστοπαθολογίας και τα αντίστοιχα δείγματα παρακείμενου φυσιολογικού αδένα. Μετά την απομόνωση του DNA από όλους τους ιστούς, το γενετικό υλικό χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη δύο διαφορετικών βιολογικών παραμέτρων: Στην πρώτη φάση, σε κάθε δείγμα ελέγχθηκαν για την ύπαρξη αστάθειας 4 μικροδορυφορικές περιοχές του DNA (D17S807, D16S301, D16S305 και GH) σε διαφορετικές χρωμοσωμικές θέσεις (17, 16q22.1, 16q24.3 και 17q22-24 αντίστοιχα), με τεχνικές ραδιενεργού PCR και αυτοραδιογραφίας. Επιπρόσθετα, εξετάσθηκε ανοσοϊστοχημικά η έκφραση των πρωτεϊνών MSH2 και MLH1, καθώς η απουσία πυρηνικής εντόπισής τους θα ήταν δείκτης ελαττωματικού επιδιορθωτικού συστήματος MMR, εξαιτίας μεταλλάξεων ή επιγενετικών τροποποιήσεων των αντίστοιχων γονιδίων. Κατά τη δεύτερη φάση, πραγματοποιήθηκε ανάλυση με PCR και DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) για τον έλεγχο μεταλλάξεων στα εξόνια 5-8 του γονιδίου p53. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία των ενδεικτικών μετάλλαξης δειγμάτων προσδιορίστηκε με sequencing. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημικός έλεγχος της έκφρασης της πρωτεΐνης P53, καθώς οι σημειακές μεταλλάξεις του γονιδίου συχνά οδηγούν σε συσσώρευση μεταλλαγμένης πρωτεΐνης. Αποτελέσματα: Δεν βρέθηκαν ενδείξεις μικροδορυφορικής αστάθειας σε κανένα από τους 4 μικροδορυφορικούς γενετικούς τόπους. Επίσης παρατηρήθηκε διατήρηση της πυρηνικής έκφρασης των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης MSH2 και MLH1, σε όλα τα καρκινώματα μαστού της μελέτης. Σε ποσοστό 20% των δειγμάτων παρουσιάστηκε κάποια μετάλλαξη του γονιδίου p53 [7 στο εξόνιο 6, 2 στο εξόνιο 7, 2 στο εξόνιο 8 και 1 στο εξόνιο 5], με την πλειονότητα να εμφανίζεται σε πορογενή διηθητικά καρκινώματα. Σε όλες (πλην μίας) τις περιπτώσεις, οι μεταλλάξεις ταυτοποιήθηκαν με sequencing. Από αυτές, δύο: g.13418T>A (p.Y220N) και g.13270delG(intr5), καταγράφονται για πρώτη φορά στον καρκίνο του μαστού. Η παρουσία μεταλλάξεων στο γονίδιο p53 έδειξε ισχυρή συσχέτιση με καρκινώματα υψηλού βαθμού κακοήθειας (grade) (p=0,002). Θετική πυρηνική ανοσοϊστοχημική χρώση της πρωτεΐνης P53 ανιχνεύθηκε στατιστικώς σημαντικά συχνότερα στα διηθητικά καρκινώματα μαστού (51%) απ’ ότι στο in situ στοιχείο (27%) (p=0,043). Η αύξηση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης παρουσίασε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση με την παρουσία μεταλλάξεων του γονιδίου (p=0,004). Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι μοριακοί μηχανισμοί στους οποίους υπόκεινται η Μικροδορυφορική Αστάθεια DNA και το ελλιπές επιδιορθωτικό σύστημα MMR, οι οποίοι είναι κρίσιμοι σε καρκίνους του εντέρου, φαίνεται να είναι εξαιρετικά σπάνιοι και να μην αποτελούν χαρακτηριστικό του σποραδικού καρκίνου του μαστού, ακόμη και σε περιπτώσεις που συνυπάρχουν μεταλλάξεις του γονιδίου p53. Λόγω της δυσκολίας στην σύγκριση και αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των διαφόρων μελετών απαιτούνται περαιτέρω έρευνες με τη χρήση περισσότερων πληροφοριακών μικροδορυφορικών δεικτών σε μεγάλες σειρές δειγμάτων ώστε να αποσαφηνιστεί πλήρως ο ρόλος τους στην καρκινογένεση στο μαστό. Όσον αφορά το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53, η PCR-DGGE ανάλυση σε συνδυασμό με sequencing, κρίνεται ως εξαιρετικά αποτελεσματική και ευαίσθητη μέθοδος ανίχνευσης γνωστών και νέων μεταλλάξεων. Με αυτή τη μεθοδολογία ανιχνεύθηκαν δύο νέες μεταλλάξεις [g.13418T>A (p.Y220N) και g.13270delG] του γονιδίου p53, οι οποίες καταγράφονται για πρώτη φορά στον καρκίνο του μαστού. Και οι δύο οδηγούσαν σε συσσώρευση μεταλλαγμένης πρωτεΐνης στον πυρήνα, ανιχνευόμενης με ανοσοϊστοχημεία. Ο συνδυασμός μεθόδων ανάλυσης/αλληλούχισης του DNA και ανοσοϊστοχημείας αποτελεί ίσως τον καλύτερο τρόπο προσέγγισης και ένα σημαντικό εργαλείο ώστε να ταυτοποιήσουμε κατά πόσο μια γονιδιακή μετάλλαξη, ανιχνεύσιμη με DNA sequencing, επηρεάζει τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης P53. Η αυξημένη παρουσία μεταλλάξεων του γονιδίου p53 και συσσώρευσης μεταλλαγμένης πρωτεΐνης σε διηθητικά καρκινώματα μαστού, καθώς και η συσχέτιση των μεταλλάξεων με υψηλό ιστολογικό grade, αναδεικνύει τον πιθανό ρόλο τους σε προχωρημένα στάδια της καρκινογένεσης του μαστού.