Μελέτη των νευροδιαβιβαστικών συστημάτων της ντοπαμίνης και του γλουταμινικού οξέος στο κεντρικό νευρικό σύστημα πειραματικών μοντέλων ...

Abstract

Basal ganglia are subcortical structures comprising several interconnected nuclei in the brain and particularly the striatum, globus pallidus, substantia nigra (SN), and subthalamic nucleus. The neural pathway that connects the substantia nigra with the striatum is one of the major dopamine pathways in the brain, and is involved in the control of movement. In the present thesis we examined the dopaminergic and glutamatergic neurotransmission systems of basal ganglia, using two different animal models. The first goal of the thesis was to investigate whether TrkA gene transfer into SN neurons of adult rats influence some of their neurochemical properties, in the absence or presence of exogenous nerve growth factor (NGF) delivery in the striatum. It is well known that neurotrophic factors are proteins which promote neuronal survival, participate in axonal growth and influence axonal targeting to establish contacts during development. In adulthood, neurotrophic factors are required to maintain neuronal functions and specific neuronal phenotype. NGF exerts its neurotrophic effects through its high affinity receptor, TrkA, which is a membrane tyrosine-kinase. In the present study, a recombinant adeno-associated virus AAV-CMV-TrkA was injected in the right substantia nigra pars compacta (SNpc) and a AAV-CBA-NGF in the ipsilateral striatum. The effects of ectopic TrkA expression on locomotor activity of the animals were assessed using the open field and rotarod tests. The expression of TrkA and NGF transgenes in SNpc and striatum, respectively, was detected by immunohistochemistry. Additionally, the effects of ectopic TrkA expression on the dopaminergic traits of nigrostriatal neurons were assessed by measuring mRNA and protein levels of the tyrosine-hydroxylase (TH), dopamine transporter (DAT), D1 and D2 dopamine (DA) receptors. The presence of TrkA transgene in SN resulted in a significant decrease of TH immunoreactivity, TH mRNA and DAT mRNA expression in the right SN compared to the contralateral side, while no difference was found in the mRNA expression of D2 DA receptors and [3H]raclopride binding in SN. No significant changes were seen in the density of DAT by measuring [3H]WIN35428 binding sites and DAT immunoreactivity in the ipsilateral striatum, as well as in the number of postsynaptic striatal D1 and D2 receptor binding sites, as determined by [3H]SCH23390 and [3H]raclopride, respectively. The glutamatergic receptors NMDA and AMPA in SN and striatum, and the GABAergic receptors GABAA in striatum were assessed by measuring mRNA levels of the GluRB subunit of AMPA receptors, [3H]AMPA binding, [3H]MK-801 binding for NMDA receptors and [3H]SR95531 for GABAA receptors. No significant changes were found in NMDA and AMPA receptors. The presence of exogenous NGF in the striatum resulted in an increase of GABAA receptors in the ipsilateral compared to the contralateral striatum. These data suggest that ectopic TrkA expression in SN downregulates tyrosine hydroxylase in nigral dopaminergic neurons, while the dopamine signaling is not affected in the striatum. Furthermore, these data suggest that ectopic TrkA expression has no significant neurotoxicity in SN or striatum, and most importantly TrkA elicits NGF-independent responses. The second goal of the present thesis was to examine the dopaminergic system of basal ganglia in a mouse model of DYT1 dystonia. Early-onset DYT1 dystonia is an autosomal dominant movement disorder caused by a 3-base pair deletion (GAG) in the DYT1 gene resulting in the loss of a glutamic acid residue in the torsinA protein. Symptoms of this disorder typically develop before the age of 21 years and include involuntary sustained muscle contractions. There are data supporting the hypothesis that basal ganglia dysfunction, and specifically dopaminergic system dysfunction, plays a role in dystonia. In the present study, we used hyperkinetic transgenic mice generated as a model of DYT1 dystonia and compared the basal ganglia dopaminergic system between transgenic mice exhibiting hyperkinesia (affected), transgenic mice not showing movement abnormalities (unaffected), and non-transgenic littermates. A decrease in the density of striatal D2 binding sites, measured by [3H]raclopride binding, and D2 mRNA expression in substantia nigra pars compacta (SNpc) was revealed in affected and unaffected transgenic mice when compared with non-transgenic. No difference in D1 receptor binding and DAT binding, measured by [3H]SCH23390 and [3H]WIN35428 binding, respectively, was found in striatum of transgenic animals. In SNpc, increased levels of DAT binding sites were observed in affected and unaffected animals compared to non-transgenic, whereas no change in DAT mRNA expression was found. These data indicate neurochemical changes in the basal ganglia dopaminergic system and suggest a possible involvement of dopamine neurotransmission in the pathophysiology of dystonia-like motor hyperactivity.

Τα βασικά γάγγλια είναι υποφλοιϊκές δομές που αποτελούνται από διάφορους διασυνδεόμενους πυρήνες στον εγκέφαλο, και ειδικότερα το ραβδωτό σώμα, την ωχρά σφαίρα, τη μέλαινα ουσία και τον υποθαλαμικό πυρήνα. Η νευρική οδός που συνδέει τη μέλαινα ουσία με το ραβδωτό σώμα είναι μια από τις σημαντικότερες ντοπαμινεργικές οδούς στον εγκέφαλο, και εμπλέκεται στον έλεγχο της κίνησης. Στην παρούσα διατριβή μελέτηθηκε το ντοπαμινεργικό και γλουταμινεργικό σύστημα νευροδιαβίβασης των βασικών γαγγλίων, χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά μοντέλα ζώων. Ο πρώτος στόχος της διατριβής ήταν να εξεταστεί εάν η μεταφορά του γονιδίου TrkA σε νευρώνες της μέλαινας ουσίας (SN) ενήλικων επίμυων επιδρά σε κάποιες από τις νευροχημικές τους ιδιότητες, απουσία ή παρουσία εξωγενούς νευροαυξητικού παράγοντα (NGF) στο ραβδωτό σώμα. Είναι γνωστό ότι οι νευροτροφικοί παράγοντες είναι πρωτεΐνες που προάγουν την επιβίωση των νευρώνων, συμμετέχουν στην αξονική αύξηση και επηρεάζουν τη δημιουργία συναπτικών επαφών κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Στην ενήλικη ζωή, οι νευροτροφικοί παράγοντες είναι απαραίτητοι για τη διατήρηση της νευρωνικής λειτουργίας και του ειδικού νευρωνικού φαινότυπου. Ο NGF ασκεί τις νευροτροφικές του ιδιότητες μέσω του υποδοχέα υψηλής συγγένειας, TrkA, ο οποίος είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με ενεργότητα κινάσης τυροσίνης. Στην παρούσα μελέτη, ο ανασυνδυασμένος αδενο-συνδεόμενος ιός AAV-CMV-TrkA εγχύθηκε στη δεξιά συμπαγή μοίρα της μέλαινας ουσίας (SNpc) και ο AAV-CBA-NGF στο ομόπλευρο ραβδωτό σώμα. Η επίδραση της εκτοπικής έκφρασης του TrkA στην κινητική δραστηριότητα των ζώων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τις δοκιμασίες του ανοιχτού πεδίου και της περιστρεφόμενης ράβδου. Η έκφραση των διαγονιδίων TrkA και NGF στην SNpc και στο ραβδωτό σώμα, αντίστοιχα, ανιχνεύθηκε με ανοσοϊστοχημεία. Επιπλέον, η επίδραση της εκτοπικής έκφρασης του TrkA στα ντοπαμινεργικά χαρακτηριστικά των μελαινοραβδωτών νευρώνων εκτιμήθηκε με τη μέτρηση των επιπέδων mRNA και πρωτεΐνης της υδροξυλάσης της τυροσίνης (ΤΗ), του μεταφορέα της ντοπαμίνης (DAT), των υποδοχέων ντοπαμίνης D1 και D2. Η παρουσία του διαγονιδίου TrkA στην SN οδήγησε σε σημαντική μείωση των επιπέδων mRNA της TH, της TH ανοσοδραστικότητας και των επιπέδων mRNA του DAT στη δεξιά SN σε σύγκριση με την ετερόπλευρη, ενώ δεν βρέθηκε καμία διαφορά στα επίπεδα mRNA των υποδοχέων ντοπαμίνης D2 και της ειδικής δέσμευσης του [3Η]raclopride στην SN. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στην πυκνότητα των θέσεων δέσμευσης του [3Η]WIN35428 στον DAT και της ανοσοδραστικότητας του DAT στο ομόπλευρο ραβδωτό σώμα, καθώς και στον αριθμό των θέσεων δέσμευσης των μετασυναπτικών υποδοχέων ντοπαμίνης D1 και D2, όπως καθορίζεται από τους ιχνηθέτες [3H]SCH23390 και [3Η] raclopride, αντίστοιχα. Οι γλουταμινεργικοί υποδοχείς NMDA και AMPA στην SN και στο ραβδωτό σώμα, και οι GABAεργικοί υποδοχείς GABAA στο ραβδωτό σώμα αξιολογήθηκαν μετρώντας τα επίπεδα mRNA της υπομονάδας GluRB των υποδοχέων AMPA, της ειδικής δέσμευσης [3H]AMPA, της ειδικής δέσμευσης [3H]MK-801 για υποδοχείς NMDA και [ 3Η]SR95531 για υποδοχείς GABAA. Δεν βρέθηκαν σημαντικές μεταβολές στους υποδοχείς NMDA και AMPA. Η παρουσία εξωγενούς NGF στο ραβδωτό σώμα είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των υποδοχέων GABAA στο ομόπλευρο σε σύγκριση με το ετερόπλευρο ραβδωτό σώμα. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η εκτοπική έκφραση του TrkA στην SN ρυθμίζει αρνητικά την υδροξυλάση της τυροσίνης των ντοπαμινεργικών νευρώνων της SN, ενώ δεν επηρεάζει την ντοπαμινεργική σηματοδότηση στο ραβδωτό σώμα. Επιπλέον, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η εκτοπική έκφραση του TrkA δεν επιφέρει σημαντική νευροτοξικότητα στην SN ή στο ραβδωτό σώμα, και το σημαντικότερο η ενεργοποίηση του υποδοχέα TrkA οδηγεί σε ανεξάρτητες από τον NGF αποκρίσεις. O δεύτερος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του ντοπαμινεργικού συστήματος σε ένα μοντέλο DYT1 δυστονίας μυός. Η DYT1 δυστονία με έναρξη σε νεαρή ηλικία είναι μία επικρατής αυτοσωματική κινητική διαταραχή που οφείλεται σε έλλειψη 3 ζευγών βάσεων (GAG) στο γονίδιο DYT1 και προκαλεί την απώλεια ενός καταλοίπου γλουταμινικού οξέος από την πρωτεΐνη τορσίνη Α. Τα κλινικά συμπτώματα αυτής της διαταραχής συνήθως αναπτύσσονται πριν την ηλικία των 21 ετών και περιλαμβάνουν ακούσιους επίμονους μυϊκούς σπασμούς. Υπάρχουν δεδομένα που υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η δυσλειτουργία των βασικών γαγγλίων και ειδικότερα η δυσλειτουργία του ντοπαμινεργικού συστήματος παίζει σημαντικό ρόλο στη δυστονία. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν υπερκινητικοί διαγονιδιακοί μυες ως μοντέλο DYT1 δυστονίας και συγκρίθηκε το ντοπαμινεργικό σύστημα των βασικών γαγγλίων μεταξύ διαγονιδιακών μυών που παρουσίαζαν υπερκινητική συμπεριφορά, διαγονιδιακών μυών που δεν παρουσίαζαν κινητικές ανωμαλίες, και μη διαγονιδιακών φυσιολογικών μυών. Σε διαγονιδιακούς μυς με υπερκινητική και μη υπερκινητική συμπεριφορά παρατηρήθηκε μείωση της πυκνότητας των υποδοχέων ντοπαμίνης D2 στο ραβδωτό σώμα, όπως προσδιορίστηκε από τη δέσμευση του [3H]raclopride, και των επιπέδων mRNA των D2 στην SNpc, σε σχέση με μη διαγονιδιακούς μυς. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στη δέσμευση του [3H]SCH23390 σε υποδοχείς ντοπαμίνης D1 ή του [3H]WIN35428 στο μεταφορέα της ντοπαμίνης (DAT) στο ραβδωτό σώμα διαγονιδιακών μυών. Στην SNpc παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα δέσμευσης στον DAT στα ζώα που παρουσίαζαν υπερκινητική και μη υπερκινητική συμπεριφορά σε σχέση με τα μη-διαγονιδιακά, ενώ δε βρέθηκαν μεταβολές στα επίπεδα mRNA του DAT. Τα δεδομένα αυτά δείχνουν νευροχημικές αλλαγές στο ντοπαμινεργικό σύστημα των βασικών γαγγλίων και προτείνουν μία πιθανή εμπλοκή της ντοπαμινεργικής νευροδιαβίβασης στην παθοφυσιολογία της δυστονικού τύπου κινητικής υπερδραστηριότητας.