Τεχνικές ανίχνευσης κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων σε καρκινώματα παχέος εντέρου

Abstract

Circulating Tumor Cells (CTCs) are detected in peripheral blood of patients with epithelial origin cancers in concentrations of 1 cancer cell per 106-107 leukocytes. They represent an important biological link in the prevalence of cancer, between primary tumor and metastatic disease. The clinical significance of their detection has been studied by several groups and it has been proven that they represent an independent prognostic factor for Disease Free and Overall Survival. They are promising markers for the evaluation of response to therapy and they could be investigated as new therapeutic targets. The so far used techniques for CTCs detection can be generally divided in cytometric techniques looking at the entire cell and the molecular techniques. Nucleic acid based techniques are mostly represented by RT-PCR whereas immunocytochemistry, Laser Scanning Cytometry, CellSearch system and Flow Cytometry are cytometric techniques. The CTCs are very rare events, thus an isolation step sould be performed before their detection. The isolation can be based on the structural characteristics of the cells (cell size and density) or by using specific tumor markers. Immunomagnetic separation can be divided into negative selection (depletion of leukocytes) using CD45 antibody and positive selection using antibodies common to all tumor cells (EpCAM) or tumor specific antibodies.Molecular techniques are considered as a gold standard for CTCs detection, because they are characterized by high sensitivity and specificity as well. Few reports have been published on the CTCs detection using Flow Cytometry.The aim of the present PhD thesis was the comparison of two methods (i.e molecular and flow cytometry) for detection and enumeration of CTCs in peripheral blood of colon cancer patients. Furthermore, to investigate any correlation between the two techniques according to their sensitivity and specificity, their LOD, and finally, the determination of cut off values and the choice of the appropriate “Tumor specific” markers.The material of the study consisted of 84 samples from peripheral blood drawals from colon cancer patients: a) before the surgery and b) the day after the surgery. The control group consisted of 16 healthy blood donors. The methods used were molecular techniques (PCR, Nested PCR and RT-PCR), along with flow cytometry.The study was conducted at the laboratory of Diagnostic Cytopathology, in the University General Hospital “Attikon”, in cooperation with the 4th Department of the University Surgery Clinic. The study protocol was approved by the Ethics Committee of the University General Hospital “Attikon”.All statistical analyses were performed using statistical package SPSS statistics for Windows Version: 20.0. For independent variables the t-test was performed and for categorical variables the Fisher’s exact test. Between-group comparison was undertaken using Mann-Whitney test. Linear correlation between two variables was evaluated using Spearman correlation (rho). P˂0.05 were considered to be statistically significant. The results are given below:Molecular techniques A statistically significant increase in the pathological samples was identified only in the detection of CK19 trranscripts (with p=0.024) using the nested method, while the correlation with the stage of tumor was weak (Grade, p=0.012). A larger sensitivity (SN) was exhibited by the CK19 nested (67.6%) with specificity (SP) 66.2%. For the CK20 and the traditional PCR for CK19 the corresponding percentages were considerably lower (SN: 2.9%, 30.9%, SP: 100%, 75%). The detection of EGFR nested exhibited SN: 22.1%, SP: 71.2%.Flow Cytometry The most significant correlation identified was for the expression of CK with carcinomas (0.256, p=0.044), with the existence of lymph node infiltration (0.380 p=0.008) and with the stage of the disease (0.391, p=0.003). For the direct protocol, considerable correlation was found with the samples of the right colon (0.369, p=0.002) and with the positivity for nested CK19 (0.241, p=0.042).The detection with the direct protocol exhibited, with threshold 3 cells/mL (cut off value), SN: 49.2% with SP: 58.3%, while the intracellular, with threshold 1 cell/mL (cut off value) SN: 62.7% with SP: 70%.To conclude, the comparison of the two techniques employed in the present doctoral thesis, namely molecular (PCR, Nested PCR and RT-PCR) and flow cytometry, demonstrated the advantage of flow cytometry, without undermining the value of molecular techniques and particularly of the currently introduced and used in modern laboratories techniques of the quantitative PCR (qPCR) and of the real-time quantitative PCR [Real‐Time Quantitative PCR (qPCR].Summarazing, CTCs can be used as an additional predictor for disease progression in newly diagnosed patients with malignant cancers and therefore are characterized as “real-time liquid biopsy”. The molecular profile of CTCs could also identify therapeutic targets such as the HER2 or EGFR for individualized therapy through the action of biological therapies with monoclonal antibodies such as Herceptin or Erbitux. Therefore, detection of CTCs in the peripheral blood could become not only an excellent non-invasive prognostic tumor marker but also an assistant in the classification of the disease and choice of therapeutic intervention.

Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTCs) είναι κύτταρα που έχουν διαφύγει από τον πρωτοπαθή όγκο και έχουν εισέλθει στην κυκλοφορία του αίματος. Οι μεταστάσεις είναι η κύρια αιτία θανάτου των ασθενών με συμπαγείς επιθηλιακούς κακοήθεις όγκους, που είναι ανθεκτικές στις συμβατικές θεραπείες (π.χ. Ca μαστού, παχέος εντέρου, προστάτου). Η αιματογενής διασπορά των καρκινικών κυττάρων από τον πρωτοπαθή όγκο είναι το καθοριστικό βήμα για τη δημιουργία μεταστάσεων και επιδρά σημαντικά στην πρόγνωση των ασθενών. Τα καρκινικά κύτταρα μεθίστανται και εγκαθίστανται σε διάφορα όργανα κάνοντας αδύνατη την εξάλειψη της νόσου με το χειρουργείο, τις ακτινοβολίες, τη χημειοθεραπεία ή τις βιολογικές θεραπείες. Η ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων θεωρείται ότι συμβάλλει στην πρώιμη διάγνωση, στην παρακολούθηση των ασθενών, ειδικά στους ασθενείς με μετάσταση, στην ανταπόκριση στις θεραπείες, αλλά και στην επιλογή του κατάλληλου θεραπευτικού σχήματος και την εξατομικευμένη θεραπεία. Οι τεχνικές ανίχνευσης των CTCs μπορούν να διαχωριστούν αδρά σε κυτταρομετρικές που εξετάζουν το κύτταρο σαν ολότητα και στην κατηγορία αυτή ανήκουν η ανοσοϊστοχημεία, η κυτταρομετρία σάρωσης με laser, το σύστημα CellSearch και η κυτταρομετρία ροής και σε μοριακές τεχνικές οι οποίες βασίζονται στην ανίχνευση νουκλεϊνικών οξέων με την RT-PCR.Με δεδομένο ότι τα CTCs αποτελούν σπάνια συμβάντα (1 καρκινικό κύτταρο σε 106-107 λευκοκύτταρα) καθίσταται αναγκαίο ένα στάδιο διαχωρισμού από τα υπόλοιπα κύτταρα του αίματος, που προηγείται της ανίχνευσης. Ο διαχωρισμός των κυττάρων μπορεί να γίνει α) βάσει των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών τους, όπως πχ. το μέγεθος και την πυκνότητα του κυττάρου χρησιμοποιώντας τη βαθμίδωση πυκνότητας (ficoll gradient) ή φίλτρα και β) με τη χρήση ειδικών δεικτών για τα καρκινικά κύτταρα (ανοσοαπομόνωση) χρησιμοποιώντας ανοσομαγνητικά σφαιρίδια. Επιπλέον, η επιλογή των κυττάρων μπορεί να είναι αρνητική (μειώνοντας τα λευκοκύτταρα) οπότε χρησιμοποιείται το CD45, θετική με τη χρήση αντισωμάτων για κάποιο αντιγόνο κοινό για πολλαπλών τύπων καρκινικά κύτταρα (EpCAM) ή ειδικό για ένα συγκεκριμένο είδος όγκου.Οι μοριακές τεχνικές αποτελούν το gold standard στην ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων καθώς χαρακτηρίζονται από υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Λίγες έως τώρα μελέτες έχουν γίνει με κυτταρομετρία ροής (ΚΡ), όμως αυτό που χαρακτηρίζει την ΚΡ είναι ότι πλεονεκτεί σε ταχύτητα και απλότητα.Σκοπός της παρούσης διδακτορικής διατριβής ήταν η συγκριτική μελέτη μεθόδων ανίχνευσης κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκινώματα παχέος εντέρου, η συσχέτιση τους ως προς την ευαισθησία και ειδικότητα τους, το όριο ανίχνευσης (traceability) τους και τέλος η συμβολή μας στις προτεινόμενες βιβλιογραφικά πολυκεντρικές μελέτες για τον καθορισμό cutoff values και την επιλογή των κατάλληλων “Tumor specific” δεικτών, από την πληθώρα των επί του παρόντος χρησιμοποιούμενων.Το υλικό της μελέτης απετέλεσαν 84 δείγματα από λήψεις περιφερικού αίματος ασθενών κατά τις φάσεις: 1) προ χειρουργείου και πριν την εφαρμογή αναισθησίας, και 2) την επόμενη της χειρουργικής επέμβασης, ενώ την ομάδα ελέγχου απετέλεσαν 16 ασθενείς χωρίς ένδειξη για ύπαρξη καρκινώματος παχέος εντέρου.Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν μοριακές τεχνικές (PCR, Nested PCR και RT-PCR) καθώς και κυτταρομετρία ροής (ΚΡ).Η μελέτη εκπονήθηκε στο Πανεπιστημιακό Γ.Ν «ΑΤΤΙΚΟΝ», στο Εργαστήριο Διαγνωστικής Κυττταρολογίας, σε συνεργασία με την Δ’ Πανεπιστημιακή Χειρουργική Κλινική. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ηθικής και Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου «ΑΤΤΙΚΟΝ», από όπου και έχει παρθεί η σχετική έγκριση.Η στατιστική ανάλυση και επεξεργασία των δεδομένων έγινε με το στατιστικό πακέτο SPSS statistics for Windows Version: 20.0. Για ανεξάρτητα δείγματα έγινε ο στατιστικός έλεγχος t-test που αφορούσε την σύγκριση της μέσης τιμής συνεχών παραμέτρων (ηλικία, αριθμός κυττάρων) στις κατηγορίες ασθενών-υγιών μαρτύρων (ποιοτικές μεταβλητές) και για κατηγορικές μεταβλητές το Fisher’s exact test. Για την συσχέτιση δύο μεταβλητών εφαρμόστηκε ο στατιστικός έλεγχος Spearman correlation (rho). Στατιστικά σημαντικές θεωρήθηκαν διαφορές με p<0.05.Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μελέτη συνοψίζονται ως εξής:Μοριακές τεχνικέςΣτατιστικά σημαντική αύξηση στα παθολογικά δείγματα αναγνωρίστηκε μόνο με την ανίχνευση των CK19 μεταγράφων (p=0.024) με την nested μέθοδο, με ασθενή συσχέτιση με το στάδιο του όγκου (Grade, p=0.012). Μεγαλύτερη ευαισθησία (SN) παρουσίασε η CK19 nested (67.6%) με ειδικότητα (SP) 66.2%. Για τις CK20 και την απλή PCR για την CK19 τα ποσοστά ήταν αρκετά χαμηλότερα (SN: 2.9%, 30.9%, SP: 100%, 75%).H ανίχνευση EGFR nested παρουσίασε SN: 22.1%, SP: 71.2%.Κυτταρομετρία ροής (ΚΡ)Οι σημαντικότερες συσχετίσεις που αναγνωρίστηκαν ήταν για την έκφραση CK με τα καρκινώματα (0.256, p=0.044), με ύπαρξη διήθησης λεμφαδένων (0.380 p=0.008) και το στάδιο της νόσου (0.391, p=0.003). Για το άμεσο πρωτόκολλο βρέθηκε σημαντική συσχέτιση με τα δείγματα από το δεξί κόλον (0.369, p=0.002) και με την θετικότητα για nested CK19 (0.241, p=0.042).H ανίχνευση με το άμεσο πρωτόκολλο παρουσίασε με όριο τα 3 κύτταρα/mL (cut off value) SN: 49.2% με SP: 58.3%, ενώ το ένδοκυττάριο με όριο τo 1 κύτταρο/mL (cut off value) SN: 62.7% με SP: 70%.Συμπερασματικά η σύγκριση μεταξύ των δύο τεχνικών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μοριακών (PCR, Nested PCR και RT-PCR) και κυτταρομετρίας ροής (ΚΡ), κατέδειξε τη δυναμική υπεροχή της κυτταρομετρίας ροής, χωρίς ωστόσο να μειώνεται η αξία των μοριακών τεχνικών και ειδικότερα η εισαγωγή και χρήση πλέον σήμερα στα σύγχρονα εργαστήρια της ποσοτικής PCR (qPCR) και της πραγματικού χρόνου ποσοτικής PCR [Real‐Time Quantitative PCR (qPCR].Τέλος θα πρέπει να τονιστεί ότι τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να αποτελέσουν έναν επιπρόσθετο προγνωστικό δείκτη για την εξέλιξη της νόσου σε νεοδιαγνωσθέντες με καρκίνο ασθενείς και χαρακτηρίζονται ως «πραγματικού χρόνου υγρή βιοψία» (“real-time liquid biopsy”).