Μελέτη μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων εντομοπαθογόνων μυκήτων

Abstract

Entomopathogenic fungi are important agents for pest biocontrol and they are used/exploited as biopesticides in many countries over the world. Three species, namely Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana and Beauveria brongniartii, belonging to subphylum Ascomycetes, parasitize over insects and are amongst the most known and widely commercialized entomopathogenic fungi. At least ten different products containing those fungi are sold in 16 different countries. Fungi belonging to these three species have been extensively studied at physiological and genetic level for elucidating their entomopathogenic action. However, the study of their mitochondrial (mt) genomes in at genetic and molecular level is very limited. Additionally, the development of molecular tools for their inter and intra- specific discrimination when applied in the field is still underdeveloped. The molecular and functional analysis of the mt genomes of representatives of these three species was the aim of this thesis. The genomes are circular DNA molecules and all three of them have the same gene content. M. anisopliae mt genome is the smallest among the three counterparts with length 24.7 Kb, while the mt genomes of Beauveria species have similar sizes of 34 Kb for B. brongniartii and 32.2 Kb for B. bassiana. Size differences among the three genomes are due to different intron number and length of intergenic regions and not because the different gene content. The three genomes studied contain the typical genes for all fungal mt genomes and their gene products participate in the formation of mitochondrial respiratory complex and in the transcriptional machinery (namely cox1-3, cob, nad1-6 and nad4L, rns, rnl and tRNAs). Mt sequences of the rest of the Ascomycetes contain the same genes except the nad genes where the majority of Saccharomycetes lacks them. The three mt genomes have common gene organization with minor differences in the organization of some trn genes. The increasing number of mt genomes of fungi from all subphyla and especially from Ascomycetes helped in expanding the study of genome organization to all these genomes. More specific, in this study, it was showed that there are three major groups of trn genes in the order of Hypocreales which are also well preserved to all classes of Pezizomycotina. Four synteny groups were revealed when the rest of mt genes were under consideration. Additionally, a common ancestral gene organization of the Sordariomycetes was determined in this study. Common genetic organization of the three genomes reflects major phylogenetic relationship, an expected conclusion as these three fungi belong to the same order. When the mt genes were compared in nucleotide and amino acid level, they showed a high percentage of similarity/identity. Phylogenetic trees were constructed based on a dataset of amino acid sequences of all protein genes as a unit from a large number of complete mt genomes of Pezizomycotina and representatives of the other subphyla. These trees clearly indicate the close relationship of the fungi examined with high bootstrap values.

Οι εντομοπαθογόνοι μύκητες αποτελούν σημαντικούς παράγοντες βιολογικού ελέγχου και χρησιμοποιούνται σαν οικολογικά εντομοκτόνα σε πολλές χώρες του κόσμου. Ασκομύκητες που παρασιτούν σε έντομα και ανήκουν στα είδη Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana και Beauveria brongniartii (Φύλο Ασκομύκητες, Υποφύλο Pezizomycotina, Κλάση Sordariomycetes, Τάξη Hypocreales) είναι από τους σημαντικότερους εντομοπαθογόνους μύκητες και δέκα διαφορετικά εμπορικά τους σκευάσματα κυκλοφορούν σε τουλάχιστον 16 χώρες. Ταυτόχρονα, αποτελούν τους εκτενέστερα μελετημένους, σε φυσιολογική και γενετική βάση, μύκητες για τη διαλεύκανση της εντομοπαθογόνου δράσης. Παρόλα αυτά, η μελέτη σε γενετικό και μοριακό επίπεδο του μιτοχονδριακού τους γονιδιώματος ήταν πολύ περιορισμένη ενώ ταυτόχρονα ήταν περιορισμένες και οι μελέτες που σχετίζονταν με την ανίχνευση μοριακών εργαλείων για την ένδο- και δια-ειδική διαφοροποίησή τους. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν τα μιτοχονδριακά (mt) γονιδιώματα των τριών μυκήτων σε δομικό και λειτουργικό επίπεδο. Τα γονιδιώματα βρέθηκαν να είναι κυκλικά μόρια DNA και να φέρουν τα ίδια γονίδια. Το mt γονιδίωμα του M. anisopliae είναι το μικρότερο με μέγεθος 24.7 Kb, ενώ τα mt γονιδιώματα των μυκήτων που ανήκουν στο γένος Beauveria έχουν αντίστοιχο μέγεθος, 34 Kb για το B. brongniartii και 32.2 Kb για το B. bassiana. Οι διαφορές στο μέγεθος δεν προέρχονται από διαφορές στη γονιδιακή οργάνωση αλλά σε διαφορές στον αριθμό των εσωνίων και στο μήκος των διαγονιδιακών περιοχών. Τα τρία mt γονιδιώματα περιέχουν τα τυπικά, για όλους τους μύκητες γονίδια, των οποίων τα προϊόντα τους συμμετέχουν στην αναπνευστική αλυσίδα (δηλ. cox1-3, cob, atp6,8,9 και nad1-6 και nad4L) και στο μεταφραστικό μηχανισμό (rns, rnl, tRNAs). Τα ίδια γονίδια έχουν εντοπιστεί στα υπόλοιπα πλήρη γονιδιώματα μυκήτων που ανήκουν στο φύλο των Ασκομυκήτων, συμπεριλαμβανομένου και των γονιδίων nad, που είναι απόντα μόνο από την πλειοψηφία των Saccharomycetes. Η οργάνωση των γονιδίων είναι κοινή στα τρία υπό μελέτη mt γονιδιώματα με μικρές διαφοροποιήσεις σε ορισμένα γονίδια tRNAs. Ο αυξανόμενος αριθμός mt γονιδιωμάτων από όλα τα υποφύλα των μυκήτων, αλλά και πιο συγκεκριμένα εντός των Ασκομυκήτων, επέτρεψε την επέκταση της μελέτης της γονιδιακής οργάνωσης. Έτσι, στην τάξη των Hypocreales εντοπίζονται τρεις κύριες ομάδες γονιδίων tRNAs που διατηρούνται σε μεγάλο βαθμό και στις υπόλοιπες τάξεις του υποφύλου των Pezizomycotina. Όταν στην μελέτη ελήφθησαν υπόψη και τα υπόλοιπα γονίδια, τότε φάνηκαν να υπάρχουν τέσσερις ομάδες συνταινικότητας, ενώ έγινε δυνατόν να προσδιοριστεί μια κοινή προγονική οργάνωση στην κλάση των Sordariomycetes. Η κοινή γονιδιακή οργάνωση αντικατοπτρίζει και μεγάλη φυλογενετική σχέση, κάτι λογικό αφού και τα τρία είδη ανήκουν στη ταξινομικά στους Hypocreales. Αυτό ήταν εμφανές από το υψηλό επίπεδο ομολογίας και ταυτότητας όταν τα γονίδια συγκρίθηκαν σε νουκλεοτιδικό και πρωτεϊνικό επίπεδο αντίστοιχα. Όταν οι αμινοξικές αλληλουχίες όλων των μιτοχονδριακών γονιδίων χρησιμοποιήθηκαν σαν μία ενιαία ομάδα και συγκρίθηκαν φυλογενετικά με αντίστοιχες ομάδες μυκήτων, το φυλογενετικό δέντρο που προέκυψε έδειξε με σαφήνεια και μεγάλη στατιστική υποστήριξη τη φυλογενετική τους σχέση.