Χαρακτηρισμός του Bacillus subtilis MBI600 ως παράγοντα βιολογικής καταπολέμησης φυτοπαθογόνων και επαγωγής της ανάπτυξης φυτών

Abstract

The use of beneficial microbes in modern agriculture is no longer considered an exception but a necessity in all cultivation strategies. Beneficial rhizobacteria are an important part of commercial products because of their ability to promote plant growth and their effectiveness against plant pathogenic microbes. Bacteria belonging to the genus Bacillus constitute the majority of beneficial microorganisms in the market. The commercial formulation Serifel® contains the biological agent Bacillus subtilis MBI600 (Bs MBI600), and in the present dissertation a systematic recording of the mechanisms of action of this beneficial microorganism is presented. In order to better understand the mechanisms of action of Bs MBI600, its whole genome was sequenced with Illumina HiSeq X. The results of the genomic analysis revealed genes associated with the production of substances that act as communication signals with host-plants, leading to successful root colonization. Furthermore, genes related to the ability of biological agents to increase the availability of plant nutrients, as well as the production of phytohormones that lead to the promotion of plant growth were also identified. Finally, genes involved in the production of antimicrobial compounds were identified in the Bs MBI600 genome.The colonization ability of Bs MBI600 on tomato and cucumber roots was studied in different soil substrates, using a yellow fluorescence protein (yfp)- transformed strain of Bs MBI600. Bacterial cells of the strain were naturally transformed by the introduction of the fluorescence protein. Transformed strains were studied using an inverted fluorescence microscope, and root surface colonization was recorded 48 hours after treatment. Subsequently, the reproducibility on different soil substrates (hydroponics, 2 soil types and sterile gnotobiotic system) was recorded. Bs MBI600, was found able to colonize the root system of both hosts in all the 4 substrates. However, significant variations were observed in the duration and survival of bacterial cells, leading to the conclusion that soil substrate plays an important role in the colonization ability.The ability of Bs MBI600 to promote plant growth and control important pathogens of cucumber or tomato was confirmed by performing a set of different experiments. Treatments with Bs MBI600 led to plants that showed increased growth, determined by measurements of several growth-related parameters (stem and root length, photosynthesis, etc.). The ability of Bs MBI600 to control tomato or cucumber pathogens was confirmed by both in vitro and in planta experiments. Bs MBI600 reduced the incidence and severity of diseases caused by: Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici -Forl, F.oxysporum f.sp. radicis cucumerinum- Forc, P. aphanidernatum and Botrytis cinerea. Some of the mechanisms that play a role in growth promotion and disease resistance were studied and identified by transcriptomic analyses in cucumber and tomato plants that were treated with Bs MBI600. Gene expression analysis showed the activation of genes related to plant defense against phytopathogenic microorganisms (PR-proteins, POD, GluA). In addition, overexpression of genes associated with the production of substances such as ethylene, jasmonate and kinases, indicated the activation of signals that play a role in the induction of systemic resistance. Similarly, overexpression of genes associated with the production of phytohormones was observed, leading to the conclusion that treatment with Bs MBI600 activates endogenous phytohormone production.In the last chapter of this thesis, the interactions between Bs MBI600 and the phytopathogenic fungus B. cinerea were studied. The antimicrobial compounds produced by Bs MB600 contributed to the direct mode of action against the pathogen. From the transcriptomic analysis in B. cinerea after its exposure to these antimicrobial compounds, mechanisms related to the detoxification of xenobiotic substances (ABC, MFS transporters) were identified. Deletion of the mfs1 gene in B. cinerea strains showed that the functions of the fungus are affected, as well as its control by the biological control agent.

Η χρήση ωφέλιμων μικροοργανισμών στην σύγχρονη γεωργία δεν αποτελεί πλέον εξαίρεση αλλά είναι απαραίτητη σε όλες τις καλλιεργητικές στρατηγικές. Τα ωφέλιμα ριζοβακτήρια αποτελούν ένα σημαντικό μέρος των εμπορικών σκευασμάτων, εξαιτίας της ικανότητας τους να προωθούν την ανάπτυξη των φυτών και να είναι αποτελεσματικά έναντι παθογόνων μικροοργανισμών. Βακτήρια που ανήκουν στο γένος Bacillus, αποτελούν την πλειοψηφία των μικροοργανισμών που διατίθενται εμπορικά ως παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης ασθενειών των φυτών. Το εμπορικό σκεύασμα Serifel® , εμπεριέχει τον βιολογικό παράγοντα BacillussubtilisMBI600 (BsMBI600), και στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται μια συστηματική καταγραφή των μηχανισμών δράσης του συγκεκριμένου ωφέλιμου μικροοργανισμού. Για την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών δράσης του BsMBI600, πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση του γονιδιώματος του μικροοργανισμού με Illumina HiSeq X. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης ανέδειξαν γονίδια που σχετίζονται με την παραγωγή ουσιών που δρουν ως σήματα επικοινωνίας με τα φυτά-ξενιστές, οδηγώντας σε επιτυχημένο αποικισμό των ριζών. Επιπλέον, ταυτοποιήθηκαν γονίδια που σχετίζονται με την ικανότητα των βιολογικών παραγόντων να αυξάνουν την διαθεσιμότητα των θρεπτικών στοιχείων των φυτών, αλλά και την παραγωγή φυτοορμονών που οδηγούν στην προαγωγή της ανάπτυξης των φυτών. Τέλος, ταυτοποιήθηκαν γονίδια που σχετίζονται με την παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών, στο γονιδίωμα το BsMBI600.H ικανότητα αποικισμού του BsMBI600 σε ρίζες φυτών τομάτας και αγγουριάς, μελετήθηκε σε διαφορετικά υποστρώματα ανάπτυξης. Βακτηριακά κύτταρά του στελέχους, μετασχηματίσθηκαν με την εισαγωγή μια κίτρινης φθορίζουσας πρωτεΐνης, με τον τρόπο της φυσικής ιδιότητας των βακτηρίων να επιτρέπουν την εισαγωγή ξένων μορίων μέσα στο κύτταρο τους (naturaltransformation). Τα μετασχηματισμένα στελέχη του BsMBI600, μελετήθηκαν με την χρήση ανεστραμμένου φθορίζοντος μικροσκοπίου, και καταγράφηκε ο επιφυτικός αποικισμός 48 ώρες μετά την εφαρμογή. Εν συνεχεία, καταγράφθηκε η ικανότητα αποικισμού σε διαφορετικά υποστρώματα ανάπτυξης (κύβοι υδροπονίας, 2 τύποι εδαφών και αποστειρωμένο σύστημα). Ο βιολογικός παράγοντας BsMBI600, κατάφερε να αποικίσει το ριζικό σύστημα των 2 ξενιστών σε όλα τα υποστρώματα, με μεγάλες διακυμάνσεις στην διάρκεια και στην επιβίωση βακτηριακών κυττάρων, οδηγώντας στο συμπέρασμα, πως το εδαφικό υπόστρωμα παίζει σημαντικό ρόλο στην ικανότητα αποικισμού.Η ικανότητα του BsMBI 600 να προάγει την ανάπτυξη των φυτών αλλά και να ελέγχει σημαντικά παθογόνα των 2 ξενιστών, επιβεβαιώθηκε από ένα σύνολο πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν. Εφαρμογές με τον βιολογικό παράγοντα, οδήγησαν σε φυτά που παρουσίασαν αύξηση σε διάφορους παράγοντες (μήκος στελέχους και ρίζας, φωτοσύνθεση κ.α.). Η βιολογική δράση του έναντι φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών επιβεβαιώθηκε τόσο με invitro πειράματα, όσο και με πειράματα σε φυτοδοχεία. Ο BsMBI600 μείωσε την εμφάνιση και την ένταση σημαντικών ασθενειών που προκαλούνται από τα παθογόνα Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, P. Aphanidernatum,Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici -Forl, F. oxysporum f.sp. radicis cucumerinum- Forc, και Botrytiscinerea. Μέρος των μηχανισμών που εμπλέκονται στην επαγωγή της ανάπτυξης και της άμυνας των φυτών μελετήθηκαν με ανάλυση της έκφρασης γονιδίων σε φυτά αγγουριάς και τομάτας που δέχθηκαν εφαρμογή με τον BsMBI600. Οι μετρήσεις της γονιδιακής έκφρασης έδειξαν την ενεργοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα του φυτού έναντι φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών (PR-proteins, POD, GluA). Επίσης καταγράφηκε υπερέκφραση γονιδίων που σχετίζονται με παραγωγή ουσιών όπως αιθυλένιο, ιασμονικο οξύ και κινάσες, που είναι γνωστό ότι λειτουργούν ως σήματα της επαγωγής διασυστηματικής αντοχής. Τέλος, καταγράφηκε υπερέκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την παραγωγή φυτοορμονών, οδηγώντας στο συμπέρασμα πως η εφαρμογή με τον βιολογικό παράγοντα συμβάλει στην επαγωγή της ανάπτυξης των φυτών τομάτας και αγγουριάς μέσω της ενεργοποίησης παραγωγής ενδογενών φυτοορμονών. Τέλος μελετήθηκε η αλληλεπίδραση μεταξύ του βιολογικού παράγοντα και του φυτοπαθογόνου μύκητα B. cinerea. Οι αντιμικροβιακές ουσίες που παράγονται από τον BsMB600 συμβάλλουν στον άμεσο τρόπο δράσης του έναντι του παθογόνου. Μέσω μεταγραφωμικής ανάλυσης σε στέλεχος του B. cinerea μετά την έκθεση του στις παραπάνω ουσίες, ταυτοποιήθηκαν μηχανισμοί που σχετίζονται με την αποτοξικοποίηση ξενοβιοτικών ουσιών (ABC, MFStransporters). H διαγραφή του γονιδίου mfs1 σε στελέχη τουμύκητα, έδειξε πως επηρεάζονται ορισμένες λειτουργίες του, αλλά και η αντιμετώπιση του από τον βιολογικό παράγοντα.