Ανάπτυξη καινοτόμων νανομορφών για στοχευμένη μεταφορά θεραπευτικών ή/και απεικονιστικών ουσιών στον εγκέφαλο

Abstract

In many cases, the delivery of therapeutic and imaging substances to the brain is impossible due to the existence of the blood-brain barrier (BBB). The application of nanotechnology to face this problem has recently begun to show signs of success. Because of the difficulties in neurodegenerative diseases therapeutics and the unmet medical need, a great effort is made in this direction.Recently, the ability of some vesicles produced by cells (extracellular vesicles or exosomes) to selectively transfer their charge to other cells located far away from the parental cells has been demonstrated. Cancer cells in particular produce extracellular vesicles with very good organotropism, which has been shown to play an important role in metastasis.The aim of this dissertation was to investigate the transport mechanisms as well as the important components that determine the organotropic action of cellular vesicles, in order to form the basis for the future development of innovative liposomal forms with increased ability for brain targeting.In the present dissertation, we studied the ability of brain targeting from cellular vesicles (CVs) derived from different cell types (normal, cancer) with different tissue origin, in order to identify the optimal compositions for brain targeting.Initially, cellular vesicles were isolated from human cerebral microvascular epithelial cells (hCMEC/D3) and from mouse skin melanoma cells (B16F10). These vesicles were characterized by size, polydispersity index and ζ-potential, the role of parental cells of CVs on their potential to facilitate delivery of their contents into cells while their ability to be engineered in order to improve their pharmacokinetics has been studied. These vesicles are non-toxic with a size of 100-200nm and a negative surface charge. The results show an increased interaction of homologous CVs with brain cells (hCMEC/D3) in vitro and in vivo, achieving the accumulation of higher amounts in the brain of mice. In addition, the effect of culture media on the targeting capacity of CVs was studied and it was shown that the specific medium for hCMEC/D3 (EndoGRO) produced CVs with a higher brain targeting capacity, compared to CVs grown in the common medium of cells, RPMI. Enrichment of CVs with cholesterol to increase vesicle integrity was only possible on membranes with low cholesterol (hCMEC/D3 CVs). Pegylation and cholesterol enrichment of CVs surface facilitated the delivery of homologous CVs to the brain. In the context of cellular vesicle engineering, the fusion of CVs with PEG-liposomes was also studied. The fusion technique was tested with different types of liposomes and CVs to confirm its functionality. The hybrids between PEG-liposomes and hCMEC CVs, although showing a slightly improved pharmacokinetics relative to the corresponding CVs, failed to replicate the same brain targeting result performed by engineered Chol/PEG CVs. The study of the potential cellular uptake pathway of each vesicle-type has shown that CVs and hybrids interact with cells primarily via the kaveolin pathway, in contrast to the engineered Chol/PEG CVs that use mostly the clathrin pathway.At the same time, the ability to encapsulate innovative neuroprotective and neuroregenerative synthetic microneurotrophins in liposomes was studied. These molecules are quite lipophilic and achieve permeability of BBB. However, their low water solubility and their way of administration, show limitations in their use in therapeutics. Initially, based on the preformulation studies, the optimal lipid compositions and methods for the preparation of liposomal microneurotrophins (BNN27 and BNN237) were determined. Attempts were then made to prepare nanoforms for intranasal administration of BNN27, with the aim of direct brain targeting, addressing the disadvantages of the intravenous route of administration. The coating of liposomes with chitosan, an agent with mucosal properties, was studied, and the optimal composition of BNN27 PC/PG (9/1) liposomes coated with 0.1 w/w chitosan/lipid was determined using chitosan with medium molecular weight as a mucoadhesive polymer. Furthermore, BNN27 nanoemulsions with mucosal agents (chitosan or Carbopol) have been developed as alternative carriers for intranasal administration of BNN27. After appropriate preformulation studies, the optimal BNN27 nanoemulsion compositions were determined. Nanoemulsions with 8% or 10% w/w Capmul MCM and chitosan at 0.3% w/w showed the optimal characteristics of stability and mucoadhesion. Tween80/ Transcutol/ Propylene glycol excipients in a ratio of 4/1/1 were used as a mixture of surfactants. These nanoforms have been characterized for their droplet size, PDI, ζ-potential and morphology. Also, they have been studied in terms of stability of their physicochemical properties, cytotoxicity, permeability of an in vitro ΒΒΒ model, as well as their in vivo fate after intranasal delivery.

Η μεταφορά θεραπευτικών και απεικονιστικών ουσιών στον εγκέφαλο, είναι σε αρκετές περιπτώσεις αδύνατη, λόγω της ύπαρξης του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (ΑΕΦ). Η εφαρμογή της νανοτεχνολογίας για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος έχει αρχίσει προσφάτως να δείχνει σημάδια επιτυχίας. Λόγω της δυσκολίας αντιμετώπισης των νευροεκφυλιστικών νόσων και της επιτακτικής ιατρικής ανάγκης που δεν έχει ως σήμερα αντιμετωπιστεί επιτυχώς, γίνεται μεγάλη προσπάθεια προς αυτή την κατεύθυνση.Πρόσφατα έχει αναδειχτεί η εξαιρετική ικανότητα ορισμένων κυστιδίων που παράγονται από τα κύτταρα (εξωκυτταρικά κυστίδια ή εξωσώματα) να μεταφέρουν επιλεκτικά το φορτίο τους σε άλλα κύτταρα που βρίσκονται πολύ μακριά από τα κύτταρα προέλευσης. Ειδικά τα καρκινικά κύτταρα παράγουν εξωσώματα με πολύ καλό οργανοτροπισμό, ο οποίος έχει αναδειχτεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στη μετάσταση.Στόχος αυτής της διατριβής ήταν η διερεύνηση των μηχανισμών μεταφοράς καθώς και των σημαντικών συστατικών που καθορίζουν την οργανοτροπική δράση κυτταρικών κυστιδίων, ώστε να αποτελέσουν τη βάση για τη μελλοντική ανάπτυξη καινοτόμων μορφών λιποσωμάτων με αυξημένη ικανότητα στόχευσης του εγκεφάλου.Στην παρούσα διατριβή έγινε μελέτη της ικανότητας στόχευσης του εγκεφάλου από κυτταρικά κυστίδια (CVs) που προέρχονται από διαφορετικούς τύπους κυττάρων (φυσιολογικά και καρκινικά) και έχουν διαφορετική ιστική προέλευση, ώστε να εντοπιστούν οι βέλτιστες συστάσεις για στόχευση του εγκεφάλου.Αρχικά, δοκιμάστηκε η απομόνωση κυτταρικών κυστιδίων από φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα εγκεφάλου hCMEC/D3 και από καρκινικά κύτταρα μελανώματος ποντικού B16F10. Τα κυστίδια αυτά χαρακτηρίστηκαν ως προς το μέγεθος, το δείκτη πολυδιασποράς και το ζ-δυναμικό, μελετήθηκε ο ρόλος των κυττάρων προέλευσης των CVs στη δυνατότητά τους να διευκολύνουν τη μεταφορά του περιεχομένου τους σε κύτταρα καθώς και η δυνατότητα τροποποίησής τους για βελτίωση της φαρμακοκινητικής τους. Τα κυστίδια αυτά είναι μη τοξικά και έχουν μέγεθος 100-200nm με αρνητικό επιφανειακό φορτίο. Απ' τα αποτελέσματα είναι εμφανής η αυξημένη αλληλεπίδραση των ομόλογων CVs με τα κύτταρα εγκεφάλου (hCMEC/D3) in vitro αλλά και in vivo επιτυγχάνοντας συσσώρευση μεγαλύτερωνποσότητων στον εγκέφαλο ποντικών. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση των μέσων καλλιέργειας στη ικανότητα στόχευσης των CVs και αποδείχτηκε ότι το ειδικό θρεπτικό μέσο για τα hCMEC/D3 (EndoGRO) οδηγεί στη δημιουργία CVs με μεγαλύτερη ικανότητα στόχευσης του εγκεφάλου, σε σύγκριση με CVs μεγαλωμένα στο κοινό θρεπτικό μέσο κυττάρων RPMI. Ο εμπλουτισμός των CVs με χοληστερόλη για αύξηση της ακεραιότητας των κυστιδίων, ήταν δυνατός μόνο σε μεμβράνες με χαμηλή περιεκτικότητα χοληστερόλης (hCMEC/D3 CVs). Η προσθήκη PEG και χοληστερόλης στην επιφάνεια των CVs διευκόλυνε τη μεταφορά των ομόλογων CVs στον εγκέφαλο. Στο πλαίσιο της τροποποίησης των κυτταρικών κυστιδίων, μελετήθηκε και η σύντηξη των CVs με PEG-λιποσώματα. Η τεχνική της σύντηξης δοκιμάστηκε με διαφορετικούς τύπους λιποσωμάτων και κυτταρικών κυστιδίων ώστε να επιβεβαιωθεί η λειτουργικότητά της. Τα υβρίδια μεταξύ PEG-λιποσωμάτων και hCMEC CVs, παρόλο που εμφάνισαν μια ελαφρώς βελτιωμένη φαρμακοκινητική σε σχέση με τα αντίστοιχα CVs, δεν κατάφεραν να επαναλάβουν την ίδια στόχευση εγκεφάλου που πραγματοποιήθηκε από τροποποιημένα Chol/PEG CVs. Στη μελέτη του μηχανισμού δράσης των διάφορων τύπων κυστιδίων που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, φαίνεται πως τα CVs και τα υβρίδια αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα κυρίως μέσω του μονοπατιού της καβεολίνης, σε αντίθεση με τα τροποποιημένα Chol/PEG CVs που χρησιμοποιούν κυρίως το μονοπάτι της κλαθρίνης.Παράλληλα, μελετήθηκε η ικανότητα εγκλωβισμού καινοτόμων νευροπροστατευτικών και νευροαναγεννητικών συνθετικών μικρονευροτροφινών σε λιποσώματα. Τα μόρια αυτά είναι αρκετά λιπόφιλα και διαπερνούν τον ΑΕΦ. Παρόλα αυτά, η χαμηλή υδατοδιαλυτότητά τους και ο τρόπος χορήγησής τους, περιορίζει τη χρήση τους στη θεραπευτική. Αρχικά, με βάση τα πειράματα προμορφοποίησης προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συστάσεις και μέθοδοι παρασκευής των λιποσωμικών μικρονευροτροφινών (ΒΝΝ27 και ΒΝΝ237). Στη συνέχεια, έγιναν προσπάθειες παρασκευής νανομορφών για ενδορρινική χορήγηση του ΒΝΝ27, με σκοπό την άμεση χορήγησή του στον εγκέφαλο και την αντιμετώπιση των μειονεκτημάτων που εμφανίζονται απ’ τη στόχευση του εγκεφάλου μέσω της ενδοφλέβιας οδού χορήγησης. Μελετήθηκε η επικάλυψη των λιποσωμάτων με χιτοζάνη, ένα παράγοντα με βλεννοσυγκολλητικές ιδιότητες, και προσδιορίστηκε η βέλτιστη σύσταση BNN27 λιποσωμάτων PC/PG (9/1) επικαλυμμένα με 0,1 w/w χιτοζάνη/ λιπίδιο, χρησιμοποιώντας τη χιτοζάνη μεσαίου μοριακού βάρους ως πολυμερές βλεννοπροσκόλλησης. Ακόμα, αναπτύχθηκαν νανογαλακτώματα ΒΝΝ27 με βλεννοσυγκολλητικούς παράγοντες (χιτοζάνη ή Carbopol), ως εναλλακτικοί φορείς ενδορρινικής χορήγησης ΒΝΝ27. Μετά τις κατάλληλες μελέτες προμορφοποίησης, προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συστάσεις ΒΝΝ27 νανογαλακτώματος. Τα νανογαλακτώματα με 8% ή 10% w/w Capmul MCM και χιτοζάνη σε ποσοστό 0,3% w/w εμφάνισαν τα βέλτιστα χαρακτηριστικά σταθερότητας και βλεννοπροσκόλλησης. Ως μίγμα επιφανειοδραστικών χρησιμοποιήθηκαν τα έκδοχα Tween 80 / Transcutol / Propylene glycol σε αναλογία 4/1/1. Οι νανομορφές αυτές αφού χαρακτηρίστηκαν ως προς το μέγεθος των σταγονιδίων, το δείκτη πολυδιασποράς, το ζ-δυναμικό και τη μορφολογία τους, μελετήθηκαν ως προς τη σταθερότητα των φυσικοχημικών τους ιδιοτήτων, την κυτταροτοξικότητα, την ικανότητα διαπέρασης ενός in vitro μοντέλου ΑΕΦ και την in vivo συμπεριφορά μετά από ενδορρινική χορήγηση.