Διερεύνηση γενετικής ποικιλότητας, ταυτοποίηση και εφαρμογή λειτουργικών δεικτών στην κερασιά (Prunus avium L.)

Abstract

Wild cherry (Prunus avium L.) is a widespread, partially asexual, noble hardwood European species characterized by a scattered distribution, small population sizes and human exploitation for its valuable wood. These characteristics, especially at the southern limits of the species natural distribution where additional varying stresses may occur render P. avium populations prone to potential stochastic, genetic and demographic events. In this study, we used dominant inter simple sequence repeats (ISSR) and co-dominant simple sequence repeats (SSR) markers to infer the genetic structure of P. avium. Five populations from northern Greece were evaluated based on 46 ISSR and 11 SSR loci. Allelic frequencies were investigated in terms of distribution and genetic structure at the gametophytic self-incompatibility locus in five wild cherry (Prunus avium L.) populations. Comparisons were also made between the differentiation at the S-locus and at the SSR loci. Theoretical expectations under balancing selection were congruent to the results observed. Nineteen Greek traditional sweet cherry cultivars and two international cultivars, which were used as controls, were grown in Greece and characterized for seventeen morpho-physiological traits, fifteen Simple Sequence Repeat (SSR) loci and ten Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) markers. The S allele genotypes of 21 sweet cherry cultivars widely grown in Greece, including 19 not previously genotyped, were determined based on their S-RNase gene products and using PCR analysis. Eight different S alleles in ten combinations, were distinguished and two new incompatibility groups were documented. Comparison of wild cherry populations and sweet cherry cultivars showed a significant reduction of genetic diversity parameters in the cultivated germplasm compared to natural populations. Bayesian, frequency-based and MCMC analyses have revealed that the wild and cultivar groups are genetically divergent and that realized between-group gene flow is almost completely absent. The application of High-Resolution-Melting (HRM) described a recent enhancement to traditional DNA melting analysis for the characterization of polymerase chain reaction products and the identification of nine gene based SNPs for distinguishing the main Greek sweet cherry cultivars. Sweet cherries can be grafted on a wide range of rootstocks belonging to genus Prunus. High Resolution Melting (HRM) analysis, coupled with five SSR markers in order to facilitate the identification of the most popular sweet cherry rootstocks in Greece. The five SSR loci used were highly informative and generated a unique melting curve profile of microsatellites for each of the six rootstocks tested. In particular, one marker, BPPCT002, with six HRM profiles was sufficient to discriminate all sweet cherry rootstocks studied. Finally, thirteen microsatellites were tested and the combination of the amplification profiles of six of them, characterised by high polymorphism and simple electrophoretic patterns, enabled to distinguish and identify a PDO sweet cherry cultivar used for sweet cherry products.

Η αγριοκερασιά (Prunus avium L.) είναι ένα ευρέως διαδεδομένο, ευγενές πλατύφυλλο ευρωπαϊκό είδος που χαρακτηρίζεται από την διάσπαρτη κατανομή, το μικρό μέγεθος πληθυσμού και την ανθρωπογενή εκμετάλλευση για την πολύτιμη και ανθεκτική ξυλεία του. Αυτά τα χαρακτηριστικά, ειδικά στα νότια όρια της φυσικής εξάπλωσης του είδους, όπου μπορεί να υφίστανται ποικίλες πρόσθετες περιβαλλοντικές πιέσεις, καθιστούν τους πληθυσμούς του P. avium επιρρεπείς σε πιθανά στοχαστικά, γενετικά και δημογραφικά γεγονότα. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν κυρίαρχοι ISSR και συγκυρίαρχοι SSR δείκτες για να διερευνηθεί η γενετική δομή του P. avium. Πέντε πληθυσμοί από τη βόρεια Ελλάδα αξιολογήθηκαν με βάση 46 ISSR και 11 SSR γονιδιακές θέσεις. Το αυτοασυμβίβαστο, ένα κοινό χαρακτηριστικό της ανάπτυξης των φυτών, είναι ένα κλασσικό παράδειγμα της εξισορροπητικής επιλογής σε φυσικούς πληθυσμούς, ιδιαίτερα της αρνητικής επιλογής της εξαρτώμενης από την συχνότητα. Σύμφωνα με την εξαρτώμενη από τη γονιδιακή συχνότητα αρνητική επιλογή, η γενετική θεωρία προβλέπει ότι η S-γονιδιακή θέση, που ελέγχει το αυτοασυμβίβαστο εμπεριέχει πολλά αλληλόμορφα σε ισομερείς συχνότητες που αποδεικνύουν ένα ευρύ φάσμα αλληλομόρφων. Ερευνήθηκαν οι συχνότητες των αλληλομόρφων όσον αφορά τη κατανομή τους και την γενετική δομή τους, στην γονιδιακή θέση που ελέγχει το γαμετοφυτικό αυτοασυμβίβαστο, σε πέντε πληθυσμούς αγριοκερασιάς (Prunus avium L.). Επίσης, έγιναν συγκρίσεις μεταξύ της διαφοροποίησης της S-γενετικής θέσης και των SSR γονιδιακών θέσεων. Δεκαεννιά ελληνικές παραδοσιακές ποικιλίες καλλιεργούμενης κερασιάς καθώς και δύο διεθνείς ποικιλίες που χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας δεκαπέντε SSR και δέκα ISSR μοριακούς δείκτες. Επιπλέον, προσδιορίστηκαν οι γενότυποι των S-αλληλομόρφων από 21 ποικιλίες κερασιάς συμπεριλαμβανομένων και 19 που δεν έχουν γενοτυπηθεί αλλά καλλιεργούνται ευρέως στην Ελλάδα, με βάση τα S-RNase γονιδιακά προϊόντα τους καθώς και τη χρήση της PCR ανάλυσης. Ακόμη, χρησιμοποιήθηκαν 9 γονιδιακές θέσεις SSR για την ανάλυση της γενετικής ποικιλότητας σε 93 άτομα άγριας και 21 άτομα καλλιεργούμενης κερασιάς που αντιπροσωπεύουν το τοπικό γενετικό υλικό. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική μείωση των γενετικών παραμέτρων στο καλλιεργούμενο γενετικό υλικό σε σύγκριση με τους φυσικούς πληθυσμούς. Οι βιο-στατιστικές προσεγγίσεις των δεδομένων της μοριακής γενετικής ανάλυσης έδειξαν ότι η ομάδα των ατόμων της αγριοκερασιάς είναι γενετικά διαφοροποιημένη από την ομάδα των καλλιεργούμενων ποικιλιών κάτι που συνεπάγεται ότι η ροή γονιδίων μεταξύ των δύο τύπων πληθυσμών είναι ασήμαντη. Περιγράφηκε η εφαρμογή της Σύγκρισης Καμπυλών Τήξης σε Υψηλή ανάλυση (HRM), που είναι μια πρόσφατη ενίσχυση στην παραδοσιακή ανάλυση τήξης DNA με σκοπό τον χαρακτηρισμό των προϊόντων της PCR και τον εντοπισμό εννέα εντοπισμένων σε γονίδια μοριακούς δείκτες SNP για τη διάκριση των κυριότερων ελληνικών ποικιλιών καλλιεργούμενης κερασιάς. Πραγματοποιήθηκε η μοριακή ταυτοποίηση των περισσότερο διαδεδομένων υποκειμένων καλλιεργούμενης κερασιάς του ελλαδικού χώρου με HRM ανάλυση πέντε μικροδορυφορικών θέσεων (SSR-HRM). Δημιουργήθηκε μια μέθοδος με βάση τους μικροδορυφορικούς δείκτες για να διακρίνει τις ποικιλίες κερασιάς ώστε να πιστοποιηθεί η ΠΟΠ ‘Τραγανά Εδέσσης’ στο επίπεδο της ποικιλίας, αλλά και στα μεταποιημένα προϊόντα στην κερασιά. Δοκιμάστηκαν δεκατρείς μικροδορυφορικοί δείκτες και ο συνδυασμός των, που χαρακτηρίζεται από υψηλό πολυμορφισμό και απλά ηλεκτροφορητικά πρότυπα, επέτρεψε την διάκριση και τον προσδιορισμό μιας ΠΟΠ ποικιλίας κερασιάς η οποία χρησιμοποιείται για παραγωγή προϊόντων.