Γενετική χαρτογράφηση στο κυπαρίσσι (Cupressus sempervirens L.)

Abstract

Cupressus sempervirens L. is an important conifer tree in the Mediterranean region, bearing two phenotypic varieties, which are associated with the crown form (C. sempervirens var. pyramidalis and C. sempervirens var. horizontalis). In this thesis, genetic linkage maps of Cupressus sempervirens for the two different varieties, including a framework consensus map and a final consensus map, are being reported. Twenty four primer combinations of fluorescent Amplified Fragment Length Polymorphism (f-AFLP) and eight fluorescent SSR markers were used and produced 1260 polymorphic loci, in a mapping family containing 382 full-sibs resulting from a controlled cross between a female horizontalis and a male pyramidalis parent applying a double pseudo-test cross strategy. The female framework map (C. sempervirens var. horizontalis) consisted of six linkage groups covering 818.58 cM. The male framework map (C. sempervirens var. pyramidalis) featured five linkage groups covering 560.33 cM. The basic framework consensus map was created by testcross segregating markers (1:1) and SSR markers presenting 11 linkage groups, and a total length of 1278.74 cM. With the addition of 3:1 f-AFLP markers the total length of the final consensus map reached 2,347.41 cM in cypress. Moreover, a QTL mapping analysis was performed. A potential QTL associated to crown form was detected with an operationally significant LOD value of 3.30. This QTL is associated with a marker that will be a marker of choice in order to evaluate and select genotypes of particular crown form at the early stages of plant development. The analysis also indicated two QTLs for height (LOD=1.65 and LOD=1.63, 0.001<p<0.004) in chromosomes three and eleven respectively. The fungus Seiridium cardinale causes a serious canker disease on cypress trees and other members of the Cupressaceae. The resistance of the mapping family to the fungus was examined. The experimental set up consisted of a six-month in-situ inoculation experiment with Seiridium cardinale in order to identify potentially resistant genotypes. The percentage of resistant, tolerant and susceptible to Seiridium cardinale genotypes, was 22.64%, 70.94% and 6.42% respectively. Two potential QTLs for resistance to Seiridium cardinale were identified (LOD= 1.78 and 1.48). Lastly and importantly a fully resistant clone has been identified to be capable of healing the artificial infection. The presence of resistant and fully resistant genotypes called for the development of protocols for in vitro propagation in cypress. An optimization of a combination of MS and SH protocols was achieved. Therefore, the in vitro propagation and mass production of the fully resistant genotype can be achieved presenting a key solution for areas in Greece that are heavily affected by the canker disease. Finally epigenetic inheritance was studied in the full-sib mapping family of Cupressus sempervirens L. by fluorescent Methylation Sensitive Amplified Polymorphism (f-MSAP). By using four primer combinations of f-MSAP molecular markers 266 polymorphic loci were found. Results showed that total methylation reached a mean value of 28.2% which was higher than the midparent value, while maternal inheritance was higher (5.65%) than paternal (3.01%). Faithfull Mendelian inheritance was low (4.29%), whereas de novo methylation in the full-sib progeny was high (19.65%).

Το κυπαρίσσι (Cupressus sempervirens L.) αποτελεί σημαντικό είδος της Μεσογειακής χλωρίδας και αποτελεί ένα από τα κύρια είδη των ευαίσθητων μεσογειακών οικοσυστημάτων που παρουσιάζει ευρεία αντοχή σε αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες. Απαντάται σε δύο κύριες μορφές λόγω της ιδιαιτερότητας της μορφής της κόμης που παρουσιάζει: την οριζοντιόκλαδη (Cupressus sempervirens var. horizontalis) και την ορθόκλαδη μορφή (Cupressus sempervirens var. pyramidalis). Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάστηκε στη λεπτομερή χαρτογράφηση του γονιδιώματος του κυπαρισσιού. Με τη χρήση 24 f-AFLP και οκτώ f-SSR εκκινητών προέκυψαν 1332 γονιδιακές θέσεις εκ των οποίων οι 1260 ήταν πολυμορφικές. Δημιουργήθηκαν τέσσερεις γενετικοί χάρτες με χρήση χαρτογραφικής οικογένειας που προήλθε από ελεγχόμενη διασταύρωση ενός οριζοντιόκλαδου θηλυκού και ενός ορθόκλαδου αρσενικού γονέα και αποτελούνταν από 382 απογόνους. Ο χάρτης πλαισίου της οριζοντιόκλαδης ποικιλίας (μητρικός) περιελάμβανε έξι ομάδες σύνδεσης συνολικού μήκους 818.58 cM και ο αντίστοιχος της ορθόκλαδης ποικιλίας (πατρικός) πέντε ομάδες σύνδεσης συνολικού μήκους γονιδιώματος 560.33 cM. Ο ενιαίος χάρτης πλαισίου που δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας τις γονιδιακές θέσεις f-AFLP με αναλογία διαχωρισμού 1:1 και τις f-SSR γονιδιακές θέσεις, αποτελείται από 11 ομάδες σύνδεσης συνολικού μήκους 1278.74 cM. Προσθέτοντας τις f-AFLP γονιδιακές θέσεις με αναλογία διαχωρισμού 3:1 το συνολικό μήκος του ολοκληρωμένου χάρτη ήταν 2.374,41 cM. Επιπρόσθετα με τη μέθοδο χαρτογράφησης διαστημάτων βρέθηκε ένα QTL που είναι συνδεδεμένο με μια f-AFLP γονιδιακή θέση στο 11ο χρωμόσωμα και σχετίζεται στατιστικά σημαντικά (LOD=3.30) με τη μορφή της κόμης. Ο δείκτης αυτός ενδέχεται να αποτελέσει μοριακό δείκτη πρώιμης επιλογής για τη μορφή της κόμης, μπορεί δηλαδή να εφαρμοστεί η υποβοηθούμενη από γονίδια σημάνσεως επιλογή (MAS) και η διερεύνηση ύπαρξης αντίστοιχων QTL σε άλλα είδη. Επιπλέον ανιχνεύθηκαν δύο QTLs με ασθενέστερη σύνδεση σε δείκτες f-AFLP στο 3ο και 11ο χρωμόσωμα για τα ποσοτικό γνώρισμα του ύψους (LOD= 1.65 και LOD=1.63, 0.001<p<0.004). Το έλκος του κυπαρισσιού προκαλείται από το μύκητα Seiridium cardinale και είναι μια από τις πιο καταστρεπτικές ασθένειες για την οικογένεια των Cupressaceae. Η αντοχή της χαρτογραφικής οικογένειας στο μύκητα εξετάστηκε χρησιμοποιώντας την τεχνική του εμβολιασμού με τον μύκητα. Μετά την πάροδο έξι μηνών καταγράφηκαν τα ποσοστά ανθεκτικών, μερικώς ανθεκτικών και ευαίσθητων στο μύκητα ατόμων που ήταν 22.64%, 70.94% και 6.42% αντίστοιχα. Στην περαιτέρω διερεύνηση, μέσω γενετικής χαρτογράφησης QTL βρέθηκαν δύο QTL ασθενώς συνδεδεμένα με δύο δείκτες f-AFLP, με τιμές LOD=1.78 (0.01<p<0.04) και LOD=1.48 (0.01<p<0.04) στo 10ο και στο 3ο χρωμόσωμα αντίστοιχα. Σημαντικό ήταν επίσης το γεγονός ότι βρέθηκε ένας γενότυπος που παρουσίασε 100% ανθεκτικότητα στο μύκητα Seiridium cardinale. Πραγματοποιήθηκε επίσης βελτιστοποίηση in-vitro πρωτοκόλλου (συνδυασμό MS και SH πρωτοκόλλων), η οποία προσφέρει τη δυνατότητα αγενούς αναπαραγωγής του ανθεκτικού κλώνου με δυνατότητα μαζικής φύτευσης του σε περιοχές της Ελλάδας με σοβαρά προβλήματα προσβολής. Τέλος μελετήθηκε η επιγενετική κληρονομησιμότητα στη χαρτογραφική οικογένεια του κυπαρισσιού χρησιμοποιώντας f-MSAP μοριακούς δείκτες. Χρησιμοποιώντας τέσσερις συνδυασμούς f-MSAP προέκυψαν 266 πολυμορφικές γονιδιακές θέσεις. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μέση τιμή της συνολικής μεθυλίωσης του DNA στους απογόνους (28.2%) ήταν υψηλότερη από τη μέση τιμή των γονικών τύπων. Επίσης βρέθηκε υψηλότερη μητρική κληρονομησιμότητα της μεθυλίωσης του DNA (5.65%) έναντι της πατρικής (3.01%). Η πιστή Μενδελική κληρονομησιμότητα μεθυλιωμένων θέσεων παρουσιάστηκε σε ένα μικρό ποσοστό (4.29%). Βρέθηκε ένα μεγάλο ποσοστό de novo μεθυλίωσης (19.65%) στους απογόνους σε σχέση με τους γονικούς τύπους.