Επιλογή, ταυτοποίηση και κλωνισμός υψηλοαποδοτικών για ρητίνη γενοτύπων χαλεπίου πεύκης (Pinus halepensis Mill.)

Abstract

Resin is a secondary forestry product of significant economic value. Its individual components are used in several different sectors of craft and industry. Resin is produced from different species of conifer trees. In Greece, the resin producing species are Aleppo pine, Brutia and Black pine, with Aleppo pine being the most productive species. The annual resin production from Aleppo pine (Pinus Halepensis) in Greece, is 2,7 kg per tree. Nevertheless, there are trees with resin yield over 12 kg. The first aim of this particular research was the localization of high-yielding, oleoresin trees, in two regions, in Kassandra, Chalkidiki and Kyrinthos, Euboia. Following the suggestions of the local resin collectors, there were spotted and, finally, chosen, 22 high yielding trees in the region of Chalkidiki and 11 from Euboia with an average annual resin yield of approximately 18 kg and 24 Kg, respectively. Also, we calculated the genetic gain for each case. The identification and separation of the selected individual trees was made with the Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) method, which was applied to the endosperm of those specific trees. After the extraction of DNA and the optimization of PCR reaction conditions, followed the selection of suitable primers. Thirty randomly selected primers were tested, from which, finally the 6 were chosen to be used for the identification and another one for the segregation study of the RAPD fragments. When the RAPD markers derive from analysis in haploid megagametophyte, they are converted into co-dominant markers. The genetic identification of the chosen individuals resulted from the alleles that each of the individual displays, for all the 68 gene loci determined. Based on the analyses all 4 individuals that were studied pose a different genotype. Complete separation of the chosen individuals can be achieved if we take under consideration 9 gene loci. The possibility of finding two individuals with identical genotype is 7.3x10-4, whereas for the total amount of the 68 gene loci the possibility is 2.7x10-20. For the study of grafting technique and survival rate, we applied the Splice, the Veneer and the Cleft grafting techniques. The splice technique proved to be the most efficient with a mean survival rate of 92,83±3,33. Next was the cleft (72,18±5,786) and third the veneer grafting technique (62,66±6,244). The application of BAP (400mg/lit) and the removal of the terminal and lateral buds had a very positive effect in the stimulation and growth of the axillary buds of the brachyblasts, with a mean number of newly formed shoots 19,33±0,589 per grafted plant. In conclusion, we could say that the effort to regenerate the resin harvesting profession should continue. Experiments in common environment in order to determine which of the selected phenotypes are at the same time excellent genotypes, as well as controlled crosses between the chosen individual trees in order to produce offsprings with even greater yield, constitute vital steps towards this goal. Finally, identifying more individual trees and multiplying them vegetatively, will contribute to the creation of new plantations with an increased production of resin.

Η ρητίνη αποτελεί ένα δευτερογενές δασικό προϊόν με ιδιαίτερη οικονομική σημασία. Τα επιμέρους συστατικά της χρησιμοποιούνται ευρέως σε διάφορους τομείς της βιοτεχνίας και βιομηχανίας. Η παραγωγή της προέρχεται από διάφορα είδη κωνοφόρων δέντρων. Στην Ελλάδα τα είδη που ρητινεύονται είναι αυτά της χαλεπίου, της τραχείας και της μαύρης πεύκης, με τη χαλέπιο να αποτελεί το κύριο ρητινοπαραγωγό είδος. Η παραγωγή ρητίνης της χαλεπίου πεύκης (Pinus halepensis) στην Ελλάδα, παρουσιάζει μια ετήσια τιμή της τάξης των 2,7 Kg κατ’άτομο. Παρόλα αυτά, έχουν εντοπιστεί άτομα των οποίων η παραγωγή ξεπερνά τα 12 Kg. Πρώτoς στόχος της παρούσας έρευνας, ήταν ο εντοπισμός υψηλοαποδοτικών σε παραγωγή ρητίνης ατόμων, στις περιοχές της Κασσάνδρας Χαλκιδικής και της Κιρύνθου στην Εύβοια. Κατόπιν υποδείξεων των ντόπιων ρητινοσυλλεκτών, εντοπίστηκαν και επιλέχθηκαν τελικά 22 άτομα στη Χαλκιδική, με μέση ετήσια παραγωγή περίπου 18 Kg και 11 άτομα στην Εύβοια, με μέση ετήσια παραγωγή περίπου 24Kg. Παράλληλα, έγινε και υπολογισμός του γενετικού κέρδους στις διάφορες περιπτώσεις. Η ταυτοποίηση και ο διαχωρισμός των επιλεγμένων ατόμων έγινε με τη μέθοδο του Τυχαία Πολλαπλασιαζόμενου Πολυμορφικού DNA (RAPD), που εφαρμόστηκε σε ενδοσπέρμια των ατόμων αυτών. Μετά την απομόνωση του DNA και τη βελτιστοποίηση της αντίδρασης PCR, ακολούθησε δοκιμή εκκινητών. Από τους 30 τυχαίους εκκινητές που δοκιμάστηκαν, επιλέχθηκαν τελικά 6 οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για την ταυτοποίηση και ένας έβδομος που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη του διαχωρισμού των RAPD θραυσμάτων. Οι RAPD δείκτες, όταν προέρχονται από ανάλυση σε απλοειδή μεγαγαμετόφυτα, ανάγονται σε συγκυρίαρχους με αποτέλεσμα, η γενετική ταυτοποίηση των επιλεγμένων ατόμων να προκύπτει από τα αλληλόμορφα που εμφανίζει το κάθε ένα από αυτά, για τις 68 γονιδιακές θέσεις που εντοπίστηκαν. Με βάση τις αναλύσεις και τα 4 άτομα που μελετήθηκαν, παρουσιάζουν διαφορετικό γενότυπο. Ο πλήρης διαχωρισμός των επιλεγμένων ατόμων, επιτυγχάνεται αν ληφθούν υπόψη 9 γονιδιακές θέσεις. Η πιθανότητα να βρεθούν δυο άτομα με ταυτιζόμενο γενότυπο είναι ίση με 7,3x10-4, ενώ για το σύνολο των 68 γονιδιακών θέσεων ίση με 2,7x10-20. Για τη μελέτη της επίδρασης της μεθόδου εμβολιασμού στο ποσοστό επιβίωσης, εφαρμόστηκαν οι μέθοδοι του Αγγλικού, του Πλάγιου και του εμβολιασμού σε Σχισμή. Αποτελεσματικότερος αποδείχθηκε ο Αγγλικός τύπος, με μέσο ποσοστό επιβίωσης 92,83±3,33, ενώ ακολουθούν ο εμβολιασμός με Σχισμή (72,18±5,786) και ο Πλάγιος (62,66±6,244). Όσον αφορά στη διέγερση και ανάπτυξη των μασχαλιαίων οφθαλμών των βραχυκλαδίων, τόσο η επίδραση της κυτοκινίνης (BAP) όσο και η αποκοπή των επάκριων οφθαλμών, επέδρασαν ευεργετικά, δίνοντας έναν συνολικό μέσο όρο νέων βλαστών ίσο με 19,33±0,589. Συμπερασματικά, θα μπορούσαμε να πούμε ότι η προσπάθεια για την αναγέννηση της ρητινοσυλλογής θα πρέπει να συνεχιστεί. Πειράματα κοινού περιβάλλοντος για την απομόνωση της επίδρασης του, ώστε να εξακριβωθεί ποιοί από τους επιλεγμένους φαινοτύπους είναι και άριστοι γενότυποι, καθώς και ελεγχόμενες διασταυρώσεις μεταξύ των επιλεγμένων ατόμων για παραγωγή απογόνων με ακόμη μεγαλύτερη απόδοση, αποτελούν ουσιαστικά βήματα προς το στόχο αυτό. Τέλος, ο εντοπισμός και άλλων ατόμων και ο πολλαπλασιασμός τους με τις τεχνικές του βλαστικού πολλαπλασιασμού, θα συμβάλουν στη δημιουργία τεχνητών φυτειών, που θα έχουν ως σκοπό την αυξημένη παραγωγή ρητίνης.