Μελέτη της έκφρασης δεικτών του κυτταρικού κύκλου καθώς και αγγειογενετικών παραγόντων σε ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, οι οποίοι υπέστησαν μερική ηπατεκτομή για θεραπευτικούς λόγους: συσχέτιση με την μετεγχειρητική επιβίωση των ασθενών και τους κλασικούς προγνωστικούς δείκτες της νόσου

Abstract

HCC is a common, yet highly aggressive neoplasm with low survival rates. As a result, the better understanding of the biology of this disease and the finding of predictive biomarkers and new therapeutic targets is of particular scientific interest. The HCC usually develops in patients with hepatitis and cirrhosis, due to chronic inflammation and damage of the hepatocytes. On a molecular level, DNA damage and genomic instability are common features of the disease. Similar to any cancer, malignant cells in HCC acquire specific characteristics, hallmarks, that allows them to sustain proliferative signaling, evade growth suppressors, resist cell death, enable replicative immortality, induce angiogenesis, and activate invasion and metastasis. Genomic instability, characterized by accumulation of mutations, is one of the major mechanisms behind the development and progression of cancer. Alongside, DNA damage due to replicative stress and the DNA damage responses are considered cornerstones of oncogenesis. Cell cycle checkpoints play a very important role in the control of proliferation and in the maintenance of genomic integrity. An important control mechanism of the cell cycle is the licensing of DNA replication. The DNA replication licensing factors control DNA replication, preventing replicative stress and genomic instability. In addition, the IPP complex (ILK-parvin-PINCH), mainly on focal adhesions, by mediating the signalling between cells and extracellular matrix (ECM) and growth factors, controls proliferation, invasion, metastasis and angiogenesis.The aim of the present study, was to evaluate the expression of cell cycle and angiogenic markers in patients with hepatocellular carcinoma. We analysed formalin-fixed paraffin-embedded biopsy specimens from a total of 111 patients who underwent hepatectomy or curative resection for HCC. In those samples, we evaluated the role of DNA replication licensing factors Cdt1 and Mcm7, DDR factors p-H2AX, phospho-ATM/ATR and p53, angiogenetic factor VEGF-A, vascular density marker CD31 and the IPP complex (ΙLK, β-parvin και PINCH). Moreover, we evaluated the prognostic significance through correlations with the clinicopathological characteristics of HCC and the survival of the patients. Our study demonstrated that Cdt1 is overexpressed in HCC, correlates with tumor grade and TNM stage and is a predictor of poor survival in patients with HCC (p=0.049). In addition, we showed that Mcm7 is also overexpressed in HCC and correlates with DDR, although, no correlations were found with the clinicopathological characteristics of HCC and the survival of the patients. Interestingly, the DDR factors p-H2AX, phospho-ATM/ATR and p53 were overexpressed in HCC and were correlated with the expression of licensing factors Cdt1 and Mcm7. Furthermore, we found that ILK is overexpressed in HCC and correlates with the studied licensing, DDR and angiogenic factors and that β-parvin and PINCH are also overexpressed in HCC. Finally, we identified that growth factor VEGF-A is overexpressed in HCC and correlates with poor survival in patients with HBV and that vascular density factor CD31 is correlated with invasion in HCC.Further studies are needed to validate our results, to identify the link between DNA licensing deregulation and genomic instability in HCC, to delineate the role of the IPP complex and to explore any possible clinical applications.

Το ΗΚΚ αποτελεί ένα πολύ συχνό και συνάμα εξαιρετικά επιθετικό νεόπλασμα με χαμηλά ποσοστά επιβίωσης. Ως αποτέλεσμα, η καλύτερη κατανόηση της βιολογίας της νόσου και η εύρεση προγνωστικών-προβλεπτικών βιοδεικτών και νέων θεραπευτικών στόχων έχει ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον. Το ΗΚΚ αναπτύσσεται συνήθως σε έδαφος ηπατίτιδας και κίρρωσης, που έχουν ως αποτέλεσμα την χρόνια φλεγμονή του παρεγχύματος και βλάβη του ηπατοκυττάρου. Σε μοριακό επίπεδο, οι βλάβες του DNA, οι γενετικές αλλαγές και η αστάθεια του γονιδιώματος αποτελούν κοινά χαρακτηριστικά της νόσου. Όπως σε όλες τις νεοπλασίες, έτσι και στο ΗΚΚ, κατά την κακοήθη εξαλλαγή τα καρκινικά κύττταρα αποκτούν ορισμένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά όπως ο ανεξέλεγκτος κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η αποφυγή της απόπτωσης, η ικανότητα διήθησης και μετάστασης και η αγγειογένεση. Η αστάθεια του γονιδιώματος, που χαρακτηρίζεται από συσσώρευση μεταλλάξεων και χρωμοσωμικών ανωμαλιών, αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους μηχανισμούς ανάπτυξης και εξέλιξης του καρκίνου, καθώς διευκολύνει την απόκτηση όλων των κύριων χαρακτηριστικών των καρκινικών κυττάρων. Ιδιαίτερα, βλάβες στο DNA λόγω αντιγραφικού στρες που ενεργοποιούν μηχανισμούς απόκρισης στην βλαβη του DNA (DDR) παρουσιάζονται αρκετά νωρίς στην καρκινογένεση. Πολύ σημαντικό ρόλο στον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και στην διατήρηση της ακεραιότητας του γονιδιώματος διαδραματίζουν οι μηχανισμοί ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Σημαντικός μηχανισμός ελέγχου του κυτταρικού κύκλου αποτελεί η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA. Οι παράγοντες αδειοδότησης αποτελούν όχι μόνο δείκτες κυτταρικού πολλαπλασιασμού, αλλά παίζουν σημαντικό ρόλο στην διατήρηση της ακεραιότητας του γονιδιώματος, καθώς αποτρέπουν την υπερ- η υπο-αντιγραφή του DNA η οποία μπορεί να οδηγήσει σε αντιγραφικό στρες και γενετική αστάθεια. Επιπλέον, το σύμπλεγμα IPP (ILK-parvin-PINCH) εντοπιζόμενο στις εστιακές συνδέσεις, παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση καθώς μεταβιβάζει σήματα από την εξωκυττάρια ουσία και αυξητικούς παράγοντες ελέγχοντας σημαντικές λειτουργίες όπως η διήθηση και η μετάσταση, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η αγγειογένεση.Με βάση τα παραπάνω η παρούσα διατριβή επικεντρώθηκε στην μελέτη της έκφρασης δεικτών του κυτταρικού κύκλου καθώς και αγγειογενετικών παραγόντων στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Συγκεκριμένα, για το σκοπό αυτό μελετήσαμε σε 111 ιστικά δείγματα ηπατοκυτταρικών καρκινωμάτων την έκφραση των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA Cdt1 και Mcm7, ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, την έκφραση των παραγόντων p-H2AX, phospho-ATM/ATR και p53, δεικτών της απόκρισης της βλάβης του DNA, την έκφραση του αγγειογενετικού παράγοντα VEGF-A και του δείκτη αγγειογένεσης CD31 και την έκφραση των συστατικών του συμπλέγματος ΙΡP (ΙLK, β-parvin και PINCH), που εμπλέκονται στον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της αγγειογένεσης. Παράλληλα, διερευνήσαμε την προγνωστική σημασία αυτών των παραγόντων αναλύοντας την σχέση τους με κλινικοπαθολογοανατομικές προγνωστικές παραμέτρους της νόσου και την επιβίωση των ασθενών.Συμπερασματικά αναδείξαμε πως ο παράγοντας αδειοδότησης Cdt1 εμφανίζει μεγαλύτερη ανοσοϊστοχημική έκφραση στο ΗΚΚ σε σχέση με το παρακείμενο μη νεοπλασματικό ηπατικό παρέγχυμα, σχετίζεται με το βαθμό διαφοροποίησης των όγκων και το στάδιο της νόσου και σχετίζεται στατιστικώς σημαντικά με χαμηλή επιβίωση των ασθενών με ΗΚΚ (p=0.049). Επιπλέον, δείξαμε πως ο παράγοντας αδειοδότησης Mcm7 εμφανίζει μεγαλύτερη ανοσοϊστοχημική έκφραση στο ΗΚΚ, αλλά δεν σχετίζεται με τους κλινικοπαθολογοανατομικούς δείκτες της νόσου και την επιβίωση των ασθενών με ΗΚΚ. Ιδιαίτερα ενδιαφέρον εύρημα της μελέτης μας ήταν ότι οι δείκτες απόκρισης της βλάβης του DNA p-H2AX, phospho-ATM/ATR και p53 εμφανίζουν μεγαλύτερη ανοσοϊστοχημική έκφραση στο ΗΚΚ και σχετίζονται με τους παράγοντες αδειοδότησης Cdt1 και Mcm7.Παράλληλα, επιβεβαιώσαμε πως η ILK υπερεκφράζεται στα ΗΚΚ και σχετίζεται με τους ρυθμιστές αδειοδότησης, τους δείκτες απόκρισης στην βλάβη του DNA (DDRs) και την αγγειογένεση, ενώ οι πρωτεΐνες β-parvin και PINCH υπερεκφράζονται στο ΗΚΚ.Επιπλέον, δείξαμε πως ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας VEGF-A εμφανίζει μεγαλύτερη ανοσοϊστοχημική έκφραση στον ηπατοκυτταρικό καρκίνο και σχετίζεται με χαμηλή επιβίωση στους ασθενείς με ηπατίτιδα Β. Τέλος, δείξαμε ότι η αγγειακή πυκνότητα (vascular density) με βάση τον ενδοθηλιακό δείκτη CD31 σχετίζεται με την παρουσία αγγειακής διήθησης στον ΗΚΚ.Αν και χρειάζονται περαιτέρω μελέτες για την επιβεβαίωση των σχέσεων που αναδείξαμε στην παρούσα μελέτη, τα δεδομένα μας συμπληρώνουν τις ως τώρα γνώσεις για την ανάπτυξη του ΗΚΚ και ανοίγουν νέους ορίζοντες στην καλύτερη κατανόηση της παθογένειας του ΗΚΚ και στην έρευνα νέων θεραπειών.