Η κλινική σημασία της ανίχνευσης κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων με multiplex PCR σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Abstract

Bladder cancer is the most common malignancy of the urinary tract and a leading cause of cancer morbidity and mortality.The standard procedure for diagnosing bladder cancer includes cystoscopy combined with cytological examination. Cystoscopy is an invasive, high-cost method and is considered the gold standard for detecting and monitoring bladder tumors, with a low sensitivity, whereas cytology is a low-sensitive operator-dependent method.There is a need for sensitive and specific non-invasive urinary markers that might reduce both cystoscopy and cost. Several markers are commercially available but none of them alone is sensitive and specific. An ideal bladder cancer marker should have high sensitivity and specificity, it should be non-invasive and easy to interpret.The presence of circulating tumor cells (CTCs) in the peripheral blood was first reported by Ashworth in 1869. Malignant cells are detached from primary tumors and become invasive. These cells may then intravasate into the blood or lymphatic circulation and subsequently extravasate from the circulation and establish a secondary tumor in another organ far from the primary tumor. The detection of CTCs has been well-demonstrated in many other malignancies. CTC detection could contribute to tumor diagnosis and identify patients with advanced bladder cancer. Polymerase chain reaction (PCR)-based methods are commonly used rapid and low-cost methods for the detection of CTCs.The aim of this study was the development of a multiplex- PCR assay for the detection of CTCs in patients with bladder cancer using primers for CK19, CK20, EGFR in peripheral blood, and SURVIVIN, hTERT and CK20 in urine samples, and to assess its potential use for clinical applications in bladder cancer patients. After a significant period of follow-up, we were able to assess a number of statistical values (sensitivity, specificity, positive and negative predictive values, progression-free and recurrence-free survival) and their potential clinical and predictive role.A total of 208 patients (177 men and 31 women) from one tertiary University Hospital, prior to surgical or any other therapeutic intervention were enrolled in the study. They were categorized into three groups. Group one included patients newly- diagnosed with bladder cancer (n=105), group two included patients with history of bladder cancer (n=64), and group three included healthy volunteers (n=39).Multiplex RT-PCR assay can provide useful information concerning bladder cancer stage, grading and progression- free and recurrence-free survival. The combination of the mRNA markers in a single reaction could be beneficial in the early detection of high-grade/clinically relevant disease and monitoring of bladder cancer patients (mainly those with high possibility to progress or recurrence), as it has previously been documented in other malignancies.

O καρκίνος της ουροδόχου κύστης είναι η πιο κοινή κακοήθεια του ουροποιητικού συστήματος και αποτελεί κύρια αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας του από καρκίνο.Η τυπική διάγνωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης πραγματοποιείται με την κυστεοσκόπηση σε συνδυασμό με την κυτταρολογική εξέταση. Η κυστεοσκόπηση είναι μια επεμβατική και υψηλού κόστους μέθοδος και, αν και θεωρείται μια εδραιωμένη διαγνωστική εξέταση (gold standard) για τον εντοπισμό και την παρακολούθηση των όγκων της ουροδόχου κύστης, παρουσιάζει χαμηλή ευαισθησία. Από την άλλη, η κυτταρολογική εξέταση είναι επίσης μια μέθοδος χαμηλής ευαισθησίας και σε μεγάλο βαθμό εξαρτώμενη από τον παρατηρητή.Υπάρχει επιτακτική ανάγκη ανέυρεσης ευαίσθητων και ειδικών δείκτών, οι οποίοι να ανιχνεύονται με μη επεμβατικές μεθόδους, γεγονός που θα μπορούσε δυνητικά να μειώσει τόσο τον αριθμό των κυστεοσκοπήσεων, όσο και το κόστος. Αρκετοί δείκτες είναι διαθέσιμοι στο εμπόριο, αλλά κανένας από αυτούς δεν παρουσιάζει ταυτόχρονα υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Ένα ιδανικός δείκτης καρκίνου της ουροδόχου κύστης θα πρέπει να έχει υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, θα πρέπει να είναι μη επεμβατικά ανιχνεύσιμος και εύκολα ερμηνεύσιμος.Η παρουσία των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (CTCs) στο περιφερικό αίμα αναφέρθηκε για πρώτη φορά από Ashworth το 1869. Τα κακοήθη κύτταρα αποσπώνται από τον πρωτοπαθή όγκο και μπορούν στη συνέχεια να εισέλθουν στο αίμα ή στη λεμφική κυκλοφορία. Η εξαγγειώση τους από την κυκλοφορία μπορεί να οδηγήσει στη δημιουργία ενός δευτερεύοντος όγκου σε άλλο όργανο μακριά από τον πρωτοπαθή όγκο. Η ανίχνευση των CTCs έχει τεκμηριωθεί σε πολλές άλλες κακοήθειες και θα μπορούσε να συμβάλει στη διάγνωση των όγκων και τον εντοπισμό ασθενών με προχωρημένο καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια ταχεία και χαμηλού κόστους μέθοδοςγια την ανίχνευση των CTCs.Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν αρχικά να αναπτυχθεί μια πολλαπλή PCR για την ανίχνευση κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων, χρησιμοποιώντας εκκινητές για τις κυτοκερατίνες CK19 και CΚ20 και τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) σε δείγματα αίματος και εκκινητές για SURVIVIN (μια πρωτεΐνη που ανήκει στις πρωτεΐνες-αναστολείς της απόπτωσης), για ανθρώπινη τελομεράση (hTERT) και για κυτοκερατίνη CΚ20 σε δείγματα ούρων. Στη συνέχεια αξιολογήθηκε η κλινική σημασία και οι κλινικές εφαρμογές αυτών των δεικτών σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Με μια σημαντική περίοδο παρακολούθησης, ήμασταν σε θέση να εκτιμήσουμε αρκετές στατιστικές παραμέτρους (ευαισθησία, ειδικότητα, θετική προγνωστική αξία, αρνητική προγνωστική αξία, επιβίωση χωρίς εξέλιξη και χωρίς υποτροπή) και να εκτιμηθεί η κλινική και προγνωστική σημασία τους.Ένα σύνολο 208 ασθενών (177 άνδρες και 31 γυναίκες) συμμετείχαν στη μελέτη. Κατηγοριοποιήθηκαν σε τρείς ομάδες. Στην πρώτη ομάδα συμμετείχαν ασθενείς με πρώτη διάγνωση καρκίνου της ουροδόχου κύστης (n = 105), η δεύτερη ομάδα περιελάμβανε ασθενείς με ιστορικό καρκίνου της ουροδόχου κύστης (n = 64), και η τρίτη ομάδα περιελάμβανε υγιείς εθελοντές (n = 39).Η δοκιμασία πολλαπλής RT-PCR μπορεί να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες σχετικά με το στάδιο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, το βαθμό κακοήθειας και την επιβίωση ελεύθερη εξέλιξης και υποτροπής. Ο συνδυασμός των δεικτών mRNA σε μία μόνο αντίδραση θα μπορούσε να είναι ωφέλιμος στην πρώιμη ανίχνευση της υψηλού βαθμού (κλινικά σημαντικής) κακοήθειας και την παρακολούθηση των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης (κυρίως εκείνων με μεγάλη πιθανότητα για εξέλιξη ή υποτροπή), όπως άλλωστε έχει προηγουμένως τεκμηριωθεί και σε άλλες κακοήθειες.