Ποικιλότητα Βασιδιομυκήτων (Agaricomycotina) σε οικοσυστήματα της Θράκης και αξιολόγηση του ενζυμικού δυναμικού τους

Abstract

The aim of present PhD thesis was to study the diversity of Basidiomycota (subphylum Agaricomycotina) in ecosystems of Thrace, specifically of Xanthi Prefecture, and the lignocellulolytic potential of selected species.The area of Xanthi is little known as regards its mycological diversity, although it includes protected areas of great importance (National Parks, Aesthetic Forests, Natural Monuments, Natura 2000 sites and Ramsar sites). To the north, Xanthi Prefecture includes a part of the Rhodope Mountains, while its southern part occupies the plain of Xanthi. Geologically, it is characterized by crystalline, igneous and sedimentary rocks.The research was based on Basidiomycota specimens collected from a variety of natural habitats in the Xanthi regional unit and on strains isolated in pure culture. Isolation of fungal strains is necessary for the study of the enzymatic potential of fungi and also completes the taxonomic study with additional information. In the context of this thesis, collections of Basidiomycota specimens were made from Xanthi Prefecture during seven visits within 15 days of work in the field, in the autumn and spring seasons of 2009-2011. In total, 598 specimens were collected from 33 different sites, including pure and mixed forests with Fagus sylvatica, Quercus spp., Betula pendula, Corylus avellana, Populus spp., Robinia pseudoacacia, Alnus glutinosa, Carpinus sp., Cornus mas, Pinus spp., Picea abies, scrub of Juniperus communis and grasslands. After the collection, attempts to isolate strains in pure culture were made and the collected specimens were preserved following desiccation. For the taxonomic study of Basidiomycota, a detailed documentation of the important macroscopical and microscopical characters of both the specimens and the corresponding strains occurred. For the identification of the fungal material, extensive literature (basic taxonomic works, monographs, specialized scientific papers) was used, and reference material was studied. All studied specimens and strains were deposited in the Dried Specimens Collection of Fungi and the Culture Collection of Fungi, respectively, of the Mycetotheca ATHUM of the National and Kapodistrian University of Athens.Each taxon is accompanied with a detailed taxonomic description and photos of the main macroscopical and microscopical morphological features, as well as with comments on their taxonomy and ecology. In a number of cases, deviations in morphological features were recorded compared with literature data, expanding the range of their diversity. In some species, the clarification of the morphological characters that distinguish them from their close relatives, in combination with the consideration of diversity limits of taxonomic characters, contributed to elucidate taxonomic problems. In addition, various nomenclatural issues were examined.In the taxonomic study, a total of 473 specimens were identified and found to belong to 244 taxa (243 species and 3 varieties), categorized in 116 genera, 48 families, 13 orders and 3 classes. Of the 244 identified taxa, 75 (30.7%) are ectomycorrhizal and 169 (69.3%) are sapotrophic or parasitic. A number of 110 wood-decomposing species were studied, most of which belong to the white-rot fungi, while very few cause brown rot. Of the 244 taxa, one genus and 26 species are new records for Greece. Furthermore, 24 species are reported for the second time, while 8 species and 2 varieties for the third time from the country. The majority of the identified species (225 taxa) are newly reported from the Xanthi Prefecture. Also, 16 species are reported from new habitats worldwide and 53 species from new habitats for Greece. The collection and study of species considered rare in Europe or even around the world has particular importance, from a taxonomic and biogeographical view, thus extending their known geographical distribution.A total of 84 fungal strains were isolated from 415 Basidiomycota specimens. The success rate of strain isolation in pure culture was 20.2%. The 84 strains correspond to 56 species, 48 genera, 22 families and 6 classes. Most species are represented by one strain, whereas some species have been isolated in pure culture more than once. Moreover, strains of four species were deposited for the first time worldwide in a Culture Collection registered in the World Data Centre for Microorganisms (WDCM).Regarding the screening of lignocellulolytic potential, 80 strains were tested using Basal Medium (BM) as solid growth medium, which contains glucose as carbon source. Remazol Brilliant Blue R (RBBR), Azo-CMC, Azo-Xylan or MnCl2 was added in BM in order to create four different media. From BM, where Azo-CMC or Azo-Xylan was added, glucose was removed so that the sole carbon source was cellulose or xylan, respectively. Note that, in the compounds Azo-CMC and Azo-Xylan, RBBR molecules are attached to glucose or xylose residues, respectively. The decolorization of the pigment RBBR indicates ligninolytic ability. Therefore, decolorization of the plates with RBBR, Azo-CMC or Azo-xylan is related to possible ligninolytic ability during the growth of strains on glucose, cellulose or xylan, respectively. The cellulolytic and xylanolytic potential was assessed from the mycelial growth on plates containing Azo-CMC and Azo-xylan, respectively. It is worth mentioning that the Azo-CMC and Azo-Xylan substrates were first used as a sole source of carbon in solid cultures in order to assess the full lignocellulolytic potential of isolates, by relating cellulolytic and xylanolytic ability to ligninolytic ability. Moreover, plates with MnCl2 were examined for any formation of brown or black flecks of MnO2, indicating peroxidase dependent manganese (MnP) activity. Of the 80 strains, 51 strains showed ligninolytic ability in the presence of glucose, 48 strains in the presence of cellulose and 46 in the presence of xylan, decolorizing the dye RBBR in the corresponding media. Furthermore, 74 and 76 isolates exhibited cellulolytic and xylanolytic ability since they grew in the medium with Azo-CMC and Azo-Xylan, respectively. Finally, 37 strains showed a positive reaction to the plates with MnCl2.For the production of endo-1,4-β-glucanase, endo-1,4-β-xylanase, laccase, lignin peroxidase (LiP) and MnP, liquid cultures were prepared. A total of 28 strains exhibited considerable lignocellulolytic ability at the agar plate screening were selected and inoculated into medium containing wheat bran and a range of inorganic components. For the measurement of enzyme activity, samples were taken from the liquid cultures during incubation. The activities of endo-1,4-β-glucanase, endo-1,4-β-xylanase, laccase, LiP and MnP were measured using the following substrates: CMC, beech xylan, ABTS, Azure B (or veratryl alcohol) and o-dianisidine (or veratryl alcohol) in the presence of MnSO4, respectively. In addition, the measurements of enzyme activity were performed in a pH range in order to determine the optimum pH for each enzyme and each strain. The activity of at least two enzymes for each strain was detected in the culture supernatant. LiP and MnP were not detected in any strain, although two different methods for measuring their activity were tested. The activity of the endo-β-xylanase of all 28 strains was detectable with enough strains producing significant levels of activity. Moreover, high activities of endo-1,4-β-glucanase and laccase produced by a remarkable number of isolates. For most strains, the optimum pH of the endo-1,4-β-glucanase and endo-1,4-β-xylanase activity was determined to 5.0, while the maximum activity of most laccases was determined at pH 2.5. Finally, it is worth mentioning that, in this thesis, the production of endo-1,4-β-glucanase by 15 species, of endo-1,4-β-glucanase by 13 species and of laccase by 8 species is mentioned for the first time worldwide.In conclusion, by studying the almost unknown diversity of Basidiomycota of Xanthi Prefecture it was emerged that this region is characterized by great mycological richness, including several species of particular taxonomic and ecological interest. This thesis provides comprehensive information on the taxonomical characters of the studied species and contributes to solving taxonomic problems and clarifying nomenclatural issues. The results of this research contribute to a better knowledge of both the diversity and the distribution of Basidiomycota in Greece. Moreover, the material of this study has enriched the collections of Mycetotheca of the University of Athens with a significant number of Basidiomycota specimens and strains. Regarding the study of enzymatic potential, the present thesis is the first extensive study where the full lignocellulolytic potential of Basidiomycota strains, indigenous to a certain geographic area, has been evaluated by studying the production of the corresponding enzymes, in solid as well as in liquid cultures. Additionally, the use of Azo-CMC and Azo-Xylan substrates as a sole carbon source proved to be a novel and successful approach to assess the full lignocellulolytic potential of strains in solid cultures. According to the results of this thesis, a large percentage of the tested strains exhibited remarkable lignocellulolytic ability, while efficient production of enzymatic activities was confirmed in liquid cultures for the most promising strains. Finally, the evaluation of lignocellulolytic potential resulted in identifying novel strains of Basidiomycota with significant lignocellulolytic ability, thus creating prospects for isolation and characterization of enzymes suitable for use in a variety of biotechnological applications.

Η παρούσα διατριβή είχε ως στόχο τη μελέτη της ποικιλότητας των Βασιδιομυκήτων του υποφύλου Agaricomycotina σε οικοσυστήματα της Θράκης, συγκεκριμένα του νομού Ξάνθης, καθώς και τη μελέτη του λιγνινοκυτταρινολυτικού δυναμικού επιλεγμένων ειδών. Η περιοχή της Ξάνθης είναι ελάχιστα γνωστή από μυκητολογική άποψη, παρότι περιλαμβάνει προστατευόμενες περιοχές μεγάλης σπουδαιότητας (Εθνικά Πάρκα, Αισθητικά Δάση, Διατηρητέα Μνημεία της Φύσης, περιοχές Natura 2000 και περιοχές Ramsar). Ο νομός Ξάνθης περιλαμβάνει προς Βορρά τμήμα της οροσειράς της Ροδόπης, ενώ το νότιο τμήμα του καταλαμβάνει ο κάμπος της Ξάνθης. Από γεωλογική άποψη χαρακτηρίζεται από κρυσταλλοσχιστώδη και πυριγενή πετρώματα, καθώς και ιζηματογενείς σχηματισμούς. Η έρευνα βασίστηκε σε δείγματα Βασιδιομυκήτων που συλλέχθηκαν από ποικιλία φυσικών οικοτόπων του νομού Ξάνθης καθώς επίσης και σε στελέχη που απομονώθηκαν σε καθαρή καλλιέργεια. Η απομόνωση στελεχών είναι απαραίτητη για τη μελέτη του ενζυμικού δυναμικού των μυκήτων και παράλληλα συμπληρώνει την ταξινομική μελέτη με πρόσθετες πληροφορίες. Στο πλαίσιο της διατριβής πραγματοποιήθηκαν συλλογές Βασιδιομυκήτων από τον νομό Ξάνθης κατά τη διάρκεια επτά επισκέψεων με 15 ημέρες εργασίας στο πεδίο, τη φθινοπωρινή και ανοιξιάτικη περίοδο των ετών 2009–2011. Συλλέχθηκαν 598 δείγματα Βασιδιομυκήτων από 33 διαφορετικές θέσεις, οι οποίες περιλαμβάνουν αμιγή και μικτά δάση με Fagus sylvatica, Quercus spp., Betula pendula, Corylus avellana, Populus spp., Robinia pseudoacacia, Alnus glutinosa, Carpinus sp., Cornus mas, Pinus spp., Picea abies, θαμνώνες Juniperus communis και λιβαδικές εκτάσεις. Αμέσως μετά τη συλλογή έγινε προσπάθεια απομόνωσης στελεχών σε καθαρή καλλιέργεια και στη συνέχεια τα συλλεχθέντα δείγματα συντηρήθηκαν μετά την αποξήρανσή τους. Για την ταξινομική μελέτη των Βασιδιομυκήτων, πραγματοποιήθηκε λεπτομερής καταγραφή των σημαντικότερων μακροσκοπικών και μικροσκοπικών ταξινομικών χαρακτήρων, τόσο των δειγμάτων όσο και των αντίστοιχων στελεχών. Για τον προσδιορισμό του υλικού χρησιμοποιήθηκε εκτεταμένη βιβλιογραφία (γενικές κλείδες, μονογραφίες γενών, εξειδικευμένα ταξινομικά άρθρα) και μελετήθηκε συγκριτικό υλικό. Το σύνολο των δειγμάτων και στελεχών που μελετήθηκαν έχουν κατατεθεί στη Συλλογή Αποξηραμένων Δειγμάτων Μυκήτων και στη Συλλογή Καλλιεργειών Μυκήτων ATHUM της Μυκητοθήκης του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών. Κάθε ταξινομική μονάδα συνοδεύεται από λεπτομερή ταξινομική περιγραφή, φωτογραφίες των κύριων μακροσκοπικών και μικροσκοπικών μορφολογικών χαρακτήρων, καθώς και ταξινομικές και οικολογικές παρατηρήσεις. Σε ορισμένες περιπτώσεις, καταγράφηκαν αποκλίσεις των μορφολογικών γνωρισμάτων συγκριτικά με τα βιβλιογραφικά δεδομένα, διευρύνοντας το εύρος της ποικιλομορφίας τους. Σε ορισμένα είδη, η διευκρίνιση των μορφολογικών χαρακτήρων που τα διακρίνουν από στενά συγγενικά τους είδη σε συνδυασμό με τη συνεκτίμηση των ορίων ποικιλομορφίας των ταξινομικών χαρακτήρων συνέβαλε στην αποσαφήνιση ταξινομικών προβλημάτων. Επίσης, έγινε διερεύνηση διαφόρων ονοματολογικών ζητημάτων. Κατά την ταξινομική μελέτη, προσδιορίστηκαν συνολικά 473 δείγματα που ανήκουν σε 244 taxa (243 είδη και 3 ποικιλίες), τα οποία κατατάσσονται σε 116 γένη, 48 οικογένειες, 13 τάξεις και 3 κλάσεις. Από τα 244 taxa που προσδιορίστηκαν, τα 75 (30,7%) θεωρούνται εκτομυκορριζικά ενώ τα 169 (69,3%) σαπροτροφικά ή παρασιτικά. Μελετήθηκαν 110 ξυλοσηπτικά είδη, η πλειονότητα των οποίων ανήκουν στους μύκητες λευκής σήψης, ενώ ελάχιστα προκαλούν καστανή σήψη. Από το σύνολο των 244 taxa, ένα γένος και 26 είδη αποτελούν νέες αναφορές για την Ελλάδα. Επιπλέον, 24 είδη αναφέρονται για δεύτερη φορά, ενώ 8 είδη και 2 ποικιλίες για τρίτη φορά από τη χώρα. Τα περισσότερα προσδιορισθέντα είδη (225 taxa) αναφέρονται για πρώτη φορά από τον νομό Ξάνθης. Επίσης, 16 είδη αναφέρονται σε νέα ενδιαιτήματα παγκοσμίως και 53 είδη σε νέα ενδιαιτήματα για την Ελλάδα. Ιδιαίτερη σημασία από ταξινομική και βιογεωγραφική άποψη έχει η ανεύρεση και μελέτη ειδών που θεωρούνται σπάνια στην Ευρώπη ή ακόμη και σε όλο τον κόσμο, καθόσον διευρύνονται τα γνωστά όρια εξάπλωσης των συγκεκριμένων ειδών. Σε καθαρή καλλιέργεια απομονώθηκαν 84 στελέχη από 415 δείγματα Βασιδιομυκήτων. Το ποσοστό επιτυχίας απομόνωσης στελεχών σε καθαρή καλλιέργεια ήταν 20,2%. Τα 84 στελέχη αντιστοιχούν σε 56 είδη, 48 γένη, 22 οικογένειες και 6 τάξεις. Τα περισσότερα είδη αντιπροσωπεύονται από ένα στέλεχος, ενώ ορισμένα είδη απομονώθηκαν σε καθαρή καλλιέργεια πάνω από μία φορά. Επιπλέον, στελέχη τεσσάρων ειδών κατατέθηκαν για πρώτη φόρα παγκοσμίως σε Συλλογή Καλλιεργειών εγγεγραμμένη στο Παγκόσμιο Κέντρο Δεδομένων για τους Μικροοργανισμούς (WDCM).Όσον αφορά τον έλεγχο του λιγνινοκυτταρινολυτικού δυναμικού, 80 στελέχη δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας ως στερεό θρεπτικό υλικό το Basal Medium (BM), το οποίο περιέχει γλυκόζη ως πηγή άνθρακα. Στο ΒΜ προστέθηκαν οι ενώσεις Remazol Brilliant Blue R (RBBR), Azo-CMC, Azo-Xylan ή MnCl2, για τη δημιουργία τεσσάρων διαφορετικών θρεπτικών υλικών. Από το BM, στο οποίο προστέθηκε η Azo-CMC ή η Azo-Xylan, αφαιρέθηκε η γλυκόζη ώστε η μοναδική πηγή άνθρακα να είναι η κυτταρίνη ή η ξυλάνη αντιστοίχως. Επισημαίνεται ότι στις ενώσεις Azo-CMC και Azo-Xylan μόρια RBBR είναι προσκολλημένα στα μόρια γλυκόζης ή ξυλόζης αντιστοίχως. Ο αποχρωματισμός της χρωστικής RBBR αποτελεί ένδειξη λιγνινολυτικής ικανότητας. Συνεπώς, ο αποχρωματισμός των τρυβλίων με RBBR, Azo-CMC ή Azo-xylan συνδέεται με ενδεχόμενη λιγνινολυτική ικανότητα κατά την ανάπτυξη των στελεχών σε γλυκόζη, κυτταρίνη ή ξυλάνη αντιστοίχως. Το κυτταρινολυτικό και ξυλανολυτικό δυναμικό αξιολογήθηκε με βάση τη μυκηλιακή ανάπτυξη σε τρυβλία που περιείχαν Azo-CMC και Azo-xylan αντιστοίχως. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα υποστρώματα Azo-CMC και Azo-Xylan χρησιμοποιήθηκαν για πρώτη φορά ως μοναδική πηγή άνθρακα σε στερεές καλλιέργειες, με σκοπό να εκτιμηθεί το πλήρες λιγνινοκυτταρινολυτικό δυναμικό των στελεχών συσχετίζοντας την κυτταρινολυτική και την ξυλανολυτική ικανότητα με τη λιγνινολυτική ικανότητα. Επίσης, τρυβλία με MnCl2 εξετάστηκαν για τυχόν σχηματισμό καστανών ή μαύρων κηλίδων του MnO2, που υποδηλώνει δράση της υπεροξειδάσης εξαρτώμενης από το μαγγάνιο (MnP). Από τα 80 στελέχη, λιγνινολυτική ικανότητα παρουσίασαν 51 στελέχη παρουσία γλυκόζης, 48 στελέχη παρουσία κυτταρίνης και 46 παρουσία ξυλάνης, αποχρωματίζοντας τη χρωστική RBBR στα αντίστοιχα θρεπτικά υλικά. Επίσης, 74 και 76 στελέχη έδειξαν κυτταρινολυτική και ξυλανολυτική ικανότητα, καθόσον αναπτύχθηκαν στο θρεπτικό υλικό με Azo-CMC και Azo-Xylan αντιστοίχως. Τέλος, 37 στελέχη έδωσαν θετική αντίδραση στα τρυβλία με το MnCl2.Για την παραγωγή των ενζύμων ενδο-1,4-β-γλυκανάση, ενδο-1,4-β-ξυλανάση, λακκάση, υπεροξειδάση της λιγνίνης (LiP) και MnP πραγματοποιήθηκαν υγρές καλλιέργειες. Επιλέχθηκαν 28 στελέχη που παρουσίασαν σημαντικό λιγνινοκυτταρινολυτικό δυναμικό στον έλεγχο με τις στερεές καλλιέργειες και εμβολιάστηκαν σε θρεπτικό υλικό που περιέχει πίτυρο σίτου και μια σειρά ανόργανων συστατικών. Για τη μέτρηση της ενζυμικής ενεργότητας, ελήφθησαν δείγματα από το υγρό θρεπτικό των καλλιεργειών κατά τη διάρκεια της επώασης. Οι ενεργότητες των ενζύμων ενδο-1,4-β-γλυκανάση, ενδο-1,4-β-ξυλανάση, λακκάση, LiP και MnP, μετρήθηκαν με τη χρήση των ακόλουθων υποστρωμάτων: CMC, ξυλάνη οξιάς, ABTS, Azure B (ή βερατρυλική αλκοόλη) και ο-διανισιδίνη (ή βερατρυλική αλκοόλη) παρουσία MnSO4 αντιστοίχως. Επιπλέον, οι μετρήσεις της ενεργότητας πραγματοποιήθηκαν σε ένα εύρος τιμών pH ώστε να προσδιοριστεί το άριστο pH για κάθε ένζυμο και για κάθε στέλεχος. Η ενεργότητα τουλάχιστον δύο ενζύμων για κάθε στέλεχος ανιχνεύτηκε στο εξωκυτταρικό διάλυμα των καλλιεργειών. Τα ένζυμα LiP και MnP δεν ανιχνεύτηκαν σε κανένα στέλεχος, παρόλο που δοκιμάστηκαν δύο διαφορετικές μέθοδοι για τη μέτρηση της ενεργότητάς τους. Η ενεργότητα της ενδο-1,4-β-ξυλανάσης και των 28 στελεχών ήταν ανιχνεύσιμη, με αρκετά στελέχη να παράγουν αξιόλογα επίπεδα ενεργότητας. Επίσης, υψηλές ενεργότητες ενδο-1,4-β-γλυκανάσης και λακκάσης παρήχθησαν από σημαντικό αριθμό στελεχών. Για την πλειονότητα των στελεχών, το άριστο pH της ενζυμικής ενεργότητας της ενδο-1,4-β-γλυκανάσης και της ενδο-1,4-β-ξυλανάσης προσδιορίστηκε στο 5.0, ενώ η μέγιστη ενεργότητα των περισσοτέρων λακκασών προσδιορίστηκε στο pH 2.5. Τέλος, αξίζει να σημειωθεί ότι στην παρούσα διατριβή η παραγωγή της ενδο-1,4-β-γλυκανάσης από 15 είδη, της ενδο-1,4-β- ξυλανάσης από 13 είδη και της λακκάσης από 8 είδη αναφέρεται για πρώτη φορά παγκοσμίως. Συμπερασματικά, από τη μελέτη της σχεδόν άγνωστης ποικιλότητας των Βασιδιομυκήτων του νομού Ξάνθης διαπιστώθηκε ότι η περιοχή χαρακτηρίζεται από μεγάλο μυκητολογικό πλούτο, συμπεριλαμβανομένων αρκετών ειδών με ιδιαίτερο ταξινομικό και οικολογικό ενδιαφέρον. Η παρούσα διατριβή παρέχει εκτενείς πληροφορίες για τους ταξινομικούς χαρακτήρες των μελετηθέντων ειδών και συμβάλλει στην επίλυση ταξινομικών προβλημάτων και στη διευκρίνηση ονοματολογικών ζητημάτων. Τα αποτελέσματα της διατριβής συνεισφέρουν στην καλύτερη γνώση τόσο της ποικιλότητας και όσο και της εξάπλωσης των Βασιδιομυκήτων στην Ελλάδα. Επιπλέον, το υλικό της διατριβής έχει εμπλουτίσει τις συλλογές της Μυκητοθήκης του Πανεπιστημίου Αθηνών με σημαντικό αριθμό δειγμάτων και στελεχών Βασιδιομυκήτων. Αναφορικά με τη μελέτη του ενζυμικού δυναμικού, η παρούσα διατριβή αποτελεί την πρώτη εκτεταμένη μελέτη όπου εκτιμήθηκε η πλήρης λιγνινοκυτταρινολυτική ικανότητα αυτοχθόνων στελεχών Βασιδιομυκήτων από ορισμένη γεωγραφική περιοχή, μελετώντας την παραγωγή των σχετικών ενζύμων τόσο σε στερεές όσο και σε υγρές καλλιέργειες. Επίσης, η χρήση των υποστρωμάτων Azo-CMC και Azo-Xylan ως μοναδικής πηγής άνθρακα αποδείχτηκε ότι είναι μια νέα και επιτυχημένη προσέγγιση στην αξιολόγηση του πλήρους λιγνινοκυτταρινολυτικού δυναμικού στελεχών σε στερεές καλλιέργειες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της διατριβής, ένα μεγάλο ποσοστό των στελεχών που δοκιμάστηκαν εμφάνισαν αξιόλογο λιγνινοκυτταρινολυτικό δυναμικό, ενώ η ικανοποιητική παραγωγή ενζυμικών ενεργοτήτων επιβεβαιώθηκε στις υγρές καλλιέργειες για τα πιο υποσχόμενα στελέχη. Τέλος, η αξιολόγηση του λιγνινοκυτταρινολυτικού δυναμικού είχε ως αποτέλεσμα τον εντοπισμό νέων στελεχών Βασιδιομυκήτων με σημαντική λιγνινοκυτταρινολυτική ικανότητα, που δημιουργεί προοπτικές για απομόνωση και χαρακτηρισμό ενζύμων κατάλληλων για αξιοποίηση σε ποικίλες βιοτεχνολογικές εφαρμογές.