Έλεγχος της δομής και της δράσης ενζύμων με υπερυψηλή πίεση: εφαρμογή στην παραγωγή και ωρίμανση γαλακτοκομικών προϊόντων

Abstract

The objective of the dissertation was to investigate the effect of High Pressure (HP) processing at mild temperatures, on the structure and activity of intracellular enzymes from lactic acid bacteria used as starter cultures of cheeses in brine. The production of a cheese with improved organoleptic, physicochemical and structural characteristics with reduced ripening time based on controlling the activity of these intracellular enzymes, was studied.The effect of HP (100–450 MPa) combined with temperature (20–40°C) on the activity of the general aminopeptidase PepN and the proline-specific aminopeptidase PepX of the strains Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ACA-DC 0105, Streptococcus thermophilus ACA-DC 0022 and Lactococcus lactis ACA-DC 0049, used as starter culture for the production of the Greek cheese in brine (Feta), was studied. The results showed activation or inactivation of aminopeptidases by HP, depending on the process conditions, and suggest interspecific variation in their pressure sensitivity. Two multi-parameter equations were developed for predicting the activation and inactivation of all aminopeptidases in the studied domain. The optimum process conditions for acceleration of the significant long-duration cheese ripening step, were selected based on maximum enzyme activation and HP process cost control. Overall, processing at 200 MPa and 20°C were selected as the optimum conditions at which maximum activation of all aminopeptidases from all studied strains could be achieved. A 20-min treatment at these conditions leads to an average threefold increase in activity which could lead to better and faster maturation of white cheese.The knowledge on the HP-induced conformational alterations in the protein structure of peptidases is of high importance, since it can contribute to elucidation of how structural changes are correlated to remaining enzyme activity. PepX isolated from S. thermophilus ACA DC 0022 was purified and found to comprise of two subunits of equal molecular mass estimated as 86 kDa by SDS-PAGE and native-PAGE electrophoresis. The effect of HP (100 to 450 MPa), at temperatures from 20 to 40°C on purified PepX activity and structure was studied. Activation of the enzyme was observed after processing at pressures 100-200 MPa and temperatures 20-30°C. More intense processing conditions led to enzyme inactivation. PepX HP-induced conformational changes were investigated, through application of Circular Dichroism spectroscopy (CD). Pressures up to 200 MPa may result in a structurally molten globule-like state, where the PepX maintains a secondary structure of untreated protein molecules, while the tertiary structure is substantially affected, leading to increase of enzyme activity. Both secondary and tertiary structures were severely affected at higher pressures (450 MPa) resulting in enzyme activity reduction.The effect of pressures 0.1-450 MPa combined with temperatures 20-40°C on the cell lysis and the ability to produce acid by the used lactic acid bacteria, was also investigated. The viability of the cells depended on the process conditions. More intense process conditions resulted in lower number of viable cells. At the optimum processing conditions (based on enzyme activity), 200 MPa 20ºC and 20 min, inactivation of the strains L. bulgaricus, S. thermophilus and L. lactis of about 2.2, 11.1 and 12.7% was observed, respectively. The HP treatment impaired acid production rate depending on the process parameters. More intense process conditions resulted in reduction of lactic acid production correlated to lower pH value decrease. A 30.3, 44.8 and 45.4% reduction of acidification ability was measured after processing at the same optimal conditions L. bulgaricus, S. thermophilus and L. lactis strains, respectively. The research was completed with the application of HP as a stage of a lab-scale production of a white cheese in brine, to validate and confirm the potential benefits of aminopeptidases activity increase in terms of reduction of ripening time and improvement of the physicochemical, organoleptic and structural characteristics of the final product. HP (200MPa-20°C-20 min) was applied directly on white brined cheese or on the starter culture used for cheese in brine manufacture (ratio: S. thermophilus:L. lactis:L. bugaricus 2:1:1). Microbial, textural, physicochemical and organoleptic characteristics as well as proteolysis progress were assessed during the 2nd stage of ripening in cold stores. The obtained results were compared to corresponding results from untreated (control) cheese.Cheeses made with HP-treated starters had increased secondary proteolysis. Organoleptic scoring of these cheeses was higher during the whole storage period compared to control and HP-treated cheese. Their superiority was evident even at the early stages of ripening in cold stores, since no bitterness was detected. Although HP treated cheeses showed the highest increase in aminopeptidases activities and proteolysis progress found to be similar as cheeses produced with partial HP treated starter culture, this was not correlated to their organoleptic evaluation. According to the obtained results, HP-treated starter culture may accelerate proteolysis and potentially the ripening of cheese-in-brine.

Η παρούσα διατριβή έχει ως αντικείμενο τη διερεύνηση της επίδρασης της συνδυασμένης εφαρμογής Υπερυψηλής πίεσης (ΥΠ) και ήπιων θερμοκρασιών, στη δομή και τη δράση ενδοκυτταρικών ενζύμων οξυγαλακτικών καλλιεργειών εκκίνησης που χρησιμοποιούνται σε τυριά άλμης. Επιπρόσθετα, αφορά στη μελέτη των πιθανών αποτελεσμάτων του ελέγχου της δράσης των ενζύμων αυτών στο στάδιο της ωρίμανσης του τυριού, με απώτερο σκοπό την παραγωγή τυριού με βελτιωμένα οργανοληπτικά, φυσικοχημικά και δομικά χαρακτηριστικά και μειωμένο χρόνο ωρίμανσης. Με στόχο την ταχύτερη ωρίμανση και τη βελτίωση των χαρακτηριστικών του τελικού προϊόντος, αρχικά κρίθηκε απαραίτητος ο καθορισμός των βέλτιστων συνθηκών επεξεργασίας των οξυγαλακτικών καλλιέργειών με ΥΠ. Ειδικότερα, διερευνήθηκε η επίδραση τριών παραμέτρων, της ΥΠ, της θερμοκρασίας και του χρόνου επεξεργασίας στη δραστικότητα της γενικής αμινοπεπτιδάσης PepN και της αμινοπεπτιδάσης ειδικής δράσης PepX, στελεχών των οξυγαλακτικών καλλιεργειών Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus και Lactococcus lactis∙ τα στελέχη που μελετήθηκαν έχουν χρησιμοποιηθεί και ως καλλιέργειες εκκίνησης κατά την παρασκευή τυριού Φέτα. Η επεξεργασία των οξυγαλακτικών καλλιεργειών με διαφορετικούς συνδυασμούς ΥΠ (100-450 MPa) και ήπιων θερμοκρασιών (20-40°C) είχε ως αποτέλεσμα τη διαφορετική συμπεριφορά των ενδοκυτταρικών ενζύμων, προκαλώντας την ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση των αμινοπεπτιδασών, ανάλογα με τις συνθήκες επεξεργασίας που εφαρμόστηκαν. Η μεταβολή της δραστικότητας των αμινοπεπτιδασών τόσο για τις συνθήκες ενεργοποίησης όσο και για τις συνθήκες απενεργοποίησης ακολούθησε κινητική πρώτης τάξης. Με την στατιστική προσαρμογή των πειραματικών αποτελεσμάτων στις αντίστοιχες μαθηματικές εξισώσεις, υπολογίστηκαν τόσο στο εύρος συνθηκών ενεργοποίησης όσο και στο εύρος των συνθηκών απενεργοποίησης, οι σταθερές των ρυθμών ενεργοποίησης/απενεργοποίησης των ενζύμων, αντίστοιχα. Αναπτύχθηκαν στη συνέχεια δευτερογενή μαθηματικά μοντέλα πρόβλεψης της δραστικότητας των αμινοπεπτιδασών, στο υπό μελέτη εύρος των συνθηκών επεξεργασίας. Μέσω των συγκεκριμένων εξισώσεων προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες επεξεργασίας με κριτήριο τη μέγιστη ενεργοποίηση των αμινοπεπτιδασών PepN και PepX, οι οποίες αντιστοιχούν σε ΥΠ 200 MPa, θερμοκρασία 20°C και χρόνο επεξεργασίας 20 min.Η διαφορετική συμπεριφορά (ενεργοποίηση/απενεργοποίηση) των συγκεκριμένων αμινοπεπτιδασών μετά από την επεξεργασία τους με ΥΠ και θερμοκρασία, θα μπορούσε να αποδοθεί στην πρόκληση δομικών μεταβολών στα ένζυμα. Για την εξήγηση της επίδρασης της ΥΠ στη δραστικότητα των ενζύμων αυτών, έγινε καθαρισμός της αμινοπεπτιδάσης PepX του στελέχους S. thermophilus και διερευνήθηκαν πιθανές μεταβολές της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής της, μετά από επεξεργασία με διάφορους συνδυασμούς ΥΠ και θερμοκρασίας. Η απομόνωση και ο καθαρισμός της αμινοπεπτιδάσης επιτεύχθηκε με εφαρμογή χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής, μοριακής διήθησης και υδροξυαπατίτη. Μετά από SDS- και Native-Page ηλεκτροφόρηση, προέκυψε ότι η αμινοπεπτιδάση PepX αποτελεί διμερή πρωτεΐνη σχετικής μοριακής μάζας 86 kDa. Πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της συνδυασμένης επίδρασης ΥΠ και θερμοκρασίας στη δραστικότητα της καθαρής PepX με σκοπό την επιβεβαίωση της διαφορετικής συμπεριφοράς στην επεξεργασία με ΥΠ της καθαρής μορφής της αμινοπεπτιδάσης PepX (ενεργοποίηση /απενεργοποίηση), τη σύγκριση με τα αποτελέσματα που προέκυψαν για τη μη καθαρή μορφή του ενζύμου και τον καθορισμό των συνθηκών επεξεργασίας του ενζύμου για την επακόλουθη μελέτη των μεταβολών της δομής του. Η καθαρή αμινοπεπτιδάση εμφάνισε παρόμοια συμπεριφορά με τη μη καθαρή της μορφή στην επεξεργασία με ΥΠ και ήπιες θερμοκρασίες (ενεργοποίηση/απενεργοποίηση), ωστόσο η πρώτη εμφανίστηκε περισσότερο ανθεκτική στις συνθήκες επεξεργασίας. Μέσω κατάλληλων μαθηματικών εξισώσεων υπολογίστηκαν τόσο στο εύρος συνθηκών ενεργοποίησης όσο και στο εύρος των συνθηκών απενεργοποίησης, οι σταθερές των ρυθμών ενεργοποίησης/απενεργοποίησης του ενζύμου, αντίστοιχα. Μέγιστη ενεργοποίηση της καθαρής PepX, εμφανίστηκε σε συνθήκες 200 MPa, 20°C και 20 min, όπως ακριβώς και στην περίπτωση της μη καθαρής της μορφής. Η μελέτη των δομικών μεταβολών της PepX μετά από επεξεργασία με ΥΠ (100-450 MPa), θερμοκρασία 20°C και χρόνο επεξεργασίας 20 min, πραγματοποιήθηκε με εφαρμογή φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωισμού. Τα φάσματα κυκλικού διχρωισμού σχετικά με τη φυσιολογική διαμόρφωση της αμινοπεπτιδάσης PepX αποκάλυψαν δύο αρνητικές ελλειπτικότητες σε μήκη κύματος 208 και 220 nm με τη δεύτερη να εμφανίζεται εντονότερη, ενώ η ανάλυση των φασμάτων της ανεπεξέργαστης PepX στο άπω υπεριώδες, αποκάλυψε ότι το 34.8% της δευτεροταγούς δομής της PepX αποτελείται από δομή α-έλικας, ενώ το 14.4% από β-πτυχωτά φύλλα και β-στροφές. Οι μεταβολές της δευτεροταγούς δομής του ενζύμου μετά από επεξεργασία με ΥΠ και ήπια θερμική επεξεργασία, εξετάστηκαν στην άπω υπεριώδη περιοχή (190-260 nm) ενώ οι μεταβολές της τριτοταγούς δομής στην εγγύς υπεριώδη περιοχή (260-360 nm). Το επεξεργασμένο με ΥΠ ένζυμο σε συνθήκες 200 MPa, 20°C και 20 min, φάνηκε να διατηρεί τη δευτεροταγή του δομή ενώ αντίθετα σημαντική απώλεια παρουσιάστηκε αναφορικά με την τριτοταγή του δομή. Αντίθετα, σε συνθήκες επεξεργασίας 450 MPa, 20°C και 20 min, παρατηρήθηκαν σημαντικές μη αντιστρεπτές μεταβολές της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής της αμινοπεπτιδάσης PepX.Έχοντας ως τελικό στόχο την παρασκευή και μελέτη λευκού τυριού άλμης τύπου Φέτας με προσθήκη καλλιέργειας εκκίνησης με ενεργοποιημένες με ΥΠ αμινοπεπτιδάσες, σε επόμενο βήμα πραγματοποιήθηκε διερεύνηση και κινητική μελέτη της επίδρασης της ΥΠ (0.1-450 MPa) και ήπιων θερμοκρασιών (20-40oC) στο φορτίο και την ικανότητα οξίνισης των προαναφερόμενων στελεχών. Η μεταβολή του φορτίου των κυττάρων εξαρτήθηκε από τις συνθήκες επεξεργασίας. Εντονότερες συνθήκες επεξεργασίας είχαν ως αποτέλεσμα τον όλο και μικρότερο αριθμό ζωντανών κυττάρων. Μέσω της εξίσωσης Baranyi, υπολογίστηκαν οι σταθερές του ρυθμού μεταβολής του φορτίου (απενεργοποίησης) των επεξεργασμένων με ΥΠ και θερμοκρασία κυττάρων. Ενδεικτικά αναφέρεται ότι σε συνθήκες επεξεργασίας 200 MPa, 20οC και 20 min, για τα στελέχη L. bulgaricus, S. thermophilus και L. lactis παρατηρήθηκε απενεργοποίηση κατά 2.2, 11.1 και 12.7%, αντίστοιχα. Η επεξεργασία με ΥΠ και ήπιες θερμοκρασίες οδήγησε σε μείωση της παραγόμενης από τους μικροοργανισμούς ποσότητας οξέος. Για όλες τις καλλιέργειες και σε όλες τις συνθήκες επεξεργασίας υπολογίστηκαν, με χρήση γραμμικής παλινδρόμησης, οι σταθερές του ρυθμού οξίνισης. Σε συνθήκες επεξεργασίας 200 MPa, 20οC και 20 min, για τα στελέχη L. bulgaricus, S. thermophilus και L. lactis παρατηρήθηκε μείωση της ικανότητας οξίνισης κατά 30.3, 44.8 και 45.4%, αντίστοιχα.Η έρευνα ολοκληρώθηκε με την εφαρμογή της ΥΠ ως στάδιο της παρασκευής λευκού τυριού άλμης τύπου Φέτας μικρής κλίμακας, για την επιβεβαίωση των δυνητικών πλεονεκτημάτων όσον αφορά τη χρονική διάρκεια του σταδίου ωρίμανσης καθώς και τη βελτίωση των φυσικοχημικών, οργανοληπτικών και δομικών χαρακτηριστικών του προϊόντος. Πραγματοποιήθηκε μελέτη της επίδρασης της χρήσης μείγματος επεξεργασμένων με ΥΠ (200 MPa-20°C-20 min) των στελεχών Lactococcus lactis ACA-DC 0049: Streptococcus thermophilus ACA-DC 0022: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ACA-DC 0105, 2:1:1, ως καλλιέργειας εκκίνησης κατά την τυροκόμηση λευκού τυριού άλμης τύπου Φέτας, μελέτη της επίδρασης του μείγματος των επεξεργασμένων με ΥΠ στελεχών ως συμπληρωματικής καλλιέργειας, καθώς και μελέτη της επίδρασης της επεξεργασίας με ΥΠ (200 MPa-20°C-20 min) του ίδιου του τυριού. Δείγματα αναφοράς (Control) μελετήθηκαν παράλληλα.Η προσθήκη κατά την τυροκόμηση επεξεργασμένων με ΥΠ καλλιεργειών εκκίνησης, οδήγησε σε αύξηση της πρωτεόλυσης κατά το δεύτερο στάδιο της ωρίμανσης του τυριού όπως φάνηκε από τα αυξημένα επίπεδα του υδατοδιαλυτού αζώτου σε 12% τριχλωροξικό οξύ και 5% φωσφοροβολφραμικό οξύ καθώς και από την ανάλυση των πεπτιδίων των εκχυλισμάτων των τυριών. Η βαθμολογία της οργανοληπτικής αξιολόγησης των συγκεκριμένων τυριών εμφανίστηκε υψηλότερη συγκριτικά με το τυρί το οποίο δεν είχε υποστεί κανενός είδους επεξεργασία (τυρί αναφοράς). Η υπεροχή των συγκεκριμένων τυριών ήταν εμφανής από την αρχή του δεύτερου σταδίου ωρίμανσης, ενώ δεν ανιχνεύτηκε και η ύπαρξη πικρής γεύσης, χαρακτηριστικό που μπορεί να παρατηρηθεί σε τυριά με περιορισμένη ωρίμανση. Αν και στο επεξεργασμένο με ΥΠ τυρί προσδιορίστηκαν οι υψηλότερες δραστικότητες των αμινοπεπτιδασών PepX και APep και η εξέλιξη της πρωτεόλυσής του βάσει των αζωτούχων ενώσεων και της ανάλυσης των πεπτιδίων φάνηκε αντίστοιχη των τυριών που παρασκευάστηκαν με μέρος επεξεργασμένης με ΥΠ καλλιέργειας, αυτό δε συμβάδισε με τα αποτελέσματα της οργανοληπτικής αξιολόγησης των συγκεκριμένων δειγμάτων.Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που προέκυψαν η προσθήκη επεξεργασμένης με ΥΠ καλλιέργειας εκκίνησης μπορεί να αυξήσει την πρωτεόλυση και κατ΄επέκταση να επιφέρει επιτάχυνση του δευτέρου σταδίου ωρίμανσης καθώς και τροποποίηση-βελτίωση των δομικών, αρωματικών και γευστικών χαρακτηριστικών λευκού τυριού άλμης τύπου Φέτας.