Μελέτη της επίδρασης της διεργασίας υπερυψηλής υδροστατικής πίεσης σε πρωτεολυτικά ένζυμα τροφίμων

Abstract

The objective of this work was to study the effect of ultra High Hydrostatic pressure (HHP) combined with temperature on the activity of proteolytic enzymes used in food technology. A kinetic analysis was conducted for each proteolytic enzyme and from the obtained results the optimum conditions for the controlled activation/inactivation were selected for each enzyme. The proteolytic enzymes and the selected HHP conditions were applied to the production process of dairy products. The effect of HHP (200-900 MPa combined with 40-80°C) on the activity of plant cystein proteases such as actinidin, ficin and papain was studied. Papain and ficin are highly pressure and temperature resistant enzymes. Actinidin appeared to be significantly more pressure and temperature sensitive, compared to papain and ficin. For all cystein proteases, a multi-parameter equation was developed to describe the effect of pressure and temperature on their inactivation rate constant. Actinidin was selected and used as milk clotting agent for the production of a “novel” dairy product, since it was the only enzyme, whose application did not cause a bitter taste to the end product. HHP could be practically used for controlling the proteolytic activity in the final product in order to avoid uncontrolled hydrolysis that leads to protein fragments and peptides of undesirable functional and sensory properties. Studies of milk coagulation using plant proteases as clotting agents, in combination with subsequent controlled inactivation with HHP have not been previously reported. The effect of the dairy substrate and the process parameters on the coagulation rate and the texture and sensory properties of the end product, were studied. Selected values of design parameters were 25% total solids, 6.49 adjusted pH, 0.35 U activity of the clotting agent actinidin, 40?C process temperature and 2 h time. These values were selected based on organoleptic acceptance of the products and minimum time for coagulation. The selected pressure-temperature conditions, 600 MPa at 40?C, were applied to stop the potentially detrimental further proteolytic action of the enzyme. Results indicated that use of actinidin for milk clotting and HHP to stop the enzyme activity in the final product leads to a “fresh cheese” type dairy product. Similar kinetic analysis to the one described for cystein proteases was also conducted for aminopeptidases from lactic acid bacteria starter cultures. These enzymes play a significant role to cheese maturation and contribute to the development of their sensory characteristics. The aim of this work was to use HHP as aminopeptidases activity regulator and increase their activity. Five aminopeptidases (PepX, PepN, PepC, PepA and PepY), from the starter cultures L. bulgaricus, L. lactis and Str. Thermophillus, were studied. Pressures (100-700 MPa) combined with temperature (20-40°C) were used for the control of their activity. Activation occurred after treatment at low pressures (not higher than 300 MPa) and low temperature (20°C). Treatment at 200 MPa and 20°C were the process conditions selected for activation of all enzymes from all microorganisms. These selected conditions were applied to the production process of a brine cheese (feta). Immature cheeses were treated at 200 and 500vMPa and 20°C. In addition, cheese was produced with the use of HHP treated (200 MPa and 20°C) starter culture. The proteolysis progress of all cheeses during maturation was recorded. A high conciseness of small peptides and amino-acids was found for cheeses produced with the use of HHP treated culture. These peptides and amino-acids are correlated with the development of the sensory and flavor characteristics of the cheeses.

Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτελεί η μελέτη της επίδρασης της υπερυψηλής υδροστατικής πίεσης (ΥΥΠ) σε συνδυασμό με θερμοκρασία στη δραστικότητα πρωτεολυτικών ενζύμων με εφαρμογές στην τεχνολογία τροφίμων. Από τα αποτελέσματα που εξήχθησαν επιλέχθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες επεξεργασίας για το κάθε ένζυμο, για τη στοχευμένη ελεγχόμενη ενεργοποίησή του ή απενεργοποίησή του και εφαρμόστηκαν στην παραγωγική διαδικασία γαλακτοκομικών προϊόντων. Σκοπός της εργασίας ήταν η συλλογή κινητικών δεδομένων για πρωτεολυτικά ένζυμα κατά την επεξεργασία τους με ΥΥΠ και η χρήση της ΥΥΠ για την ανάπτυξη ενός «νέου» γαλακτοκομικού προϊόντος, αλλά και η ενσωμάτωσή της στην τεχνολογία παρασκευής λευκών τυριών άλμης. Μελετήθηκε η επίδραση της ΥΥΠ (200-900 MPa σε συνδυασμό με θερμοκρασίες 40-80°C) στη δραστικότητα των κυστεϊνικών πρωτεασών ακτινιδίνη, φικίνη και παπαΐνη. Η φικίνη και η παπαΐνη είναι αρκετά ανθεκτικά ένζυμα κατά τη συνδυαστική επεξεργασία με ΥΥΠ και θερμοκρασία. Για την απενεργοποίησή τους απαιτούνται πιέσεις υψηλότερες από 750 MPa σε συνδυασμό με θερμοκρασία μεγαλύτερη από 70°C. Η ακτινιδίνη εμφανίστηκε αρκετά πιο ευαίσθητη κατά την επεξεργασία της με ΥΥΠ. Από τα τρία ένζυμα, για περαιτέρω μελέτη της παραγωγής ενός νέου γαλακτοκομικού προϊόντος επιλέχθηκε η ακτινιδίνη ως παράγοντας πήξης του γάλακτος μιας και ήταν το μόνο ένζυμο που δεν προσέδιδε πικρή γεύση στα τελικά πήγματα. Επιπλέον, απαιτούσε ηπιότερες συνθήκες για την αναγκαία απενεργοποίησή της με ΥΥΠ στο πήγμα. Παρόμοιες μελέτες παραγωγής τέτοιων συστημάτων στο παρελθόν αντιμετώπιζαν πρόβλημα με την περαιτέρω δράση του ενζύμου μετά την πήξη των προϊόντων και δεν υπήρχε τρόπος ελέγχου της, μιας και η θερμική επεξεργασία θα κατάστρεφε τη δομή τους. Στην παρούσα διατριβή, έγινε προσπάθεια αντιμετώπισης αυτού του προβλήματος με εφαρμογή ΥΥΠ. Για την παρασκευή του νέου προϊόντος γάλακτος, μελετήθηκαν κρίσιμες παράμετροι για την ποιότητά του, όπως τα ολικά στερεά του γάλακτος, η τιμή pH του, η θερμοκρασία και ο απαιτούμενος χρόνος για την πήξη των προϊόντων, καθώς και η προστιθέμενη ποσότητα ενζύμου ακτινιδίνης. Οι τελικές τιμές των παραμέτρων επιλέχθηκαν με βάση την οργανοληπτική αποδοχή των προϊόντων, αλλά και τον ελάχιστο απαιτούμενο χρόνο πήξης αυτών. Η ΥΥΠ εφαρμόστηκε για την απενεργοποίηση της ακτινιδίνης. Παρόμοια κινητική μελέτη με τις αντίστοιχες των απενεργοποιήσεων των κυστεϊνικών πρωτεασών πραγματοποιήθηκε και για ενδοκυτταρικές αμινοπεπτιδάσες προερχόμενες από οξυγαλακτικές καλλιέργειες εκκίνησης, οι οποίες συμβάλλουν στην ωρίμανση τυριών κι επομένως και στη δημιουργία των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών τους. Στόχος της διατριβής ήταν η καινοτόμος εφαρμογή της ΥΥΠ για την αύξηση και όχι τη μείωσή της δραστικότητας ενζύμων. Μελετήθηκαν πέντε αμινοπεπτιδάσες (PepX, PepN, PepC, PepA και PepY) προερχόμενες από τις οξυγαλακτικές καλλιέργειες L. bulgaricus, L. lactis και Str. thermophillus. Πιέσεις (100-700 MPa) σε συνδυασμό με θερμοκρασίες (20-40°C) χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της δραστικότητας των ενζύμων. Τα αποτελέσματα για όλες τις αμινοπεπτιδάσες προερχόμενες από όλες τις καλλιέργειες έδειξαν ενεργοποίησή τους μετά από επεξεργασία σε χαμηλές πιέσεις (μικρότερες από 300 MPa) και θερμοκρασίες (20°C). Με βάση την κινητική μελέτη ενεργοποίησης/απενεργοποίησης των συγκεκριμένων ενζύμων επιλέχθηκαν ως συνθήκες επεξεργασίας για την αύξηση της δραστικότητάς τους τα 200 MPa και 20°C. Τα αποτελέσματα των κινητικών δεδομένων των αμινοπεπτιδασών χρησιμοποιήθηκαν κατά την παραγωγή τυριών άλμης. Έτοιμα τυριά υπέστησαν επεξεργασία με ΥΥΠ στα 200 και 500 MPa και 20°C. Παρήχθη και τυρί άλμης με καλλιέργεια επεξεργασμένη με ΥΥΠ στα 200 MPa και 20°C. Μελετήθηκε η εξέλιξη της πρωτεόλυσης κατά την ωρίμανσή τους (παραγωγή αζωτούχων κλασμάτων). Τα τυριά που παρήχθησαν με την επεξεργασμένη με ΥΥΠ καλλιέργεια στις ίδιες συνθήκες είχαν αυξημένη περιεκτικότητα σε μικρά πεπτίδια και αμινοξέα, γεγονός που συνδέεται με την ανάπτυξη γευστικών και αρωματικών συστατικών.