Μοριακή και φυλογενετική μελέτη των νοροϊών

Abstract

Noroviruses (NoVs) are a major causative agent of acute gastroenteritis in humans. Noroviruses are members of the Caliciviridae family and based on the genetic analysis of the RdRp and capsid regions, human NoVs are divided into three genogroups (Gs), GI, GII, and GIV, which further segregate into distinct lineages called genotypes. The NoV genus is genetically diverse and recombination of viral RNA is known to depend upon various immunological and intracellular constraints that may allow the emergence of viable recombinants.Noroviruses (NoVs) are a major cause of epidemic acute gastroenteritis affecting 96% of people worldwide. Viral gastroenteritis is now well documented in most of the industrialized countries, in contrast to Greece where epidemiological data concerning NoVs are still lacking.For this purpose, in the present PhD thesis, the detection and molecular characterisation of circulating recombinant Noroviruses was performed, in order to create important informationon the evolution, pathogenesis and spread of these viruses in the population of central Greece. Sewage samples and fecal specimens were collected from central Greece and molecular techniques, that documented the genetic relationships between the circulating recombinant and non recombinant strains were assess.The first Noroviral stain which was characterized during the present study was isolated from the clinical sample A6. The detection was carried out initially by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the subsequent detection and molecular characterization of NoV strain was achieved by reverse transcription-PCR and sequencing. RT-PCR assay for GII NoVs that targets conserved regions of the genome, allowed the characterization of A6 strain at the molecular level, established its genetic relationship at the sub-genogroup level and classified A6 strain at the sub-genotype level by performing phylogenetic analyses with other GII NoVs that have previously been grouped into genotypes. Based on the sequence analysis, A6 strain was revealed to belong to the GII genogroup of NoVs. Partial ORF1 gene sequencing analysis and complete ORF2 gene sequencing revealed that ORF1 and ORF2 belonged to two distinct genotypes GII/9 and GII/6, respectively, making obvious that A6 strain was a rare intergenotypic recombinant within the genogroup GII between GII.9 and GII.6 genotypes.Subsequently, in an attempt to discern the circulation of the above intergenotypic recombinant GII.9/GII.6, we investigated NoVs from samples collected from raw sewages between the years 2006 to 2011 and compared the results with Noroviruses detected from clinical samples in the same area and in the same time period. Two specific primer pairs for NoVs were designed which amplified in a single PCR fragment from polymerase to capsid gene covering the widespread recombination point in ORF1/ORF2 junction. Based on the genetic analysis, recombinant NoV strains GII.9/GII.6 were identified. Fourteen out of 15 environmental and eight out of ten clinical samples that were used in the present study were positive, with both primer pairs, confirming that the intergenotypic recombinant GII.9/GII.6 was circulating in the population of central Greece from 2006 to 2011. The crossover point was identified to be within the overlapping region of ORF1/ORF2 (GII.9/GII.6, respectively) and was determined by Simplot at nucleotide position 5,032 bp.Finally, three more Noroviral strains were detected in clinical samples collected in the University Hospital of Ioannina, Greece that revealed a hitherto unobserved recombination event between GII.9/GII.4 and GII.9/GI.7 genogroups. Moreover a novel strain was also detected in clinical sample AK1 belonging to GII.4 genocluster. Phylogenetic analysis classified AK1 strain as GII.4 genotype, but formingclearly a new cluster at the nucleotide level, according to BLAST clustering.

Οι Νοροιοί αποτελούν σημαντικά παθογόνα του ανθρώπου, γνωστά για την πρόκληση οξείας γαστρεντερίτιδας. Είναι μέλη της οικογένειας Caliciviridae και με βάση τη γενετική ανάλυση της RNA-εξαρτώμενης RNA πολυμεράσης (RdRp) και περιοχών του καψιδίου, οι Νοροϊοί που προσβάλλουν τον άνθρωπο χωρίζονται σε τρεις γενετικές ομάδες (GS), GI, GII και GIV, οι οποίες διαχωρίζονται περαιτέρω σε γενότυπους. Το γονιδίωμα των νοροϊών είναι ποικιλόμορφο καθώς οι ανασυνδυασμοί του ιικού RNA εξαρτώνται από διάφορους ανοσολογικούς και ενδοκυτταρικούς περιορισμούς, οι οποίοι μπορεί να επιτρέψουν την ανάδειξη βιώσιμων στελεχών. Παγκοσμίως, οι Νοροϊοί χαρακτηρίζονται ως ο βασικός παράγοντας εμφάνισης γαστρεντερικών λοιμώξεων και ευθύνονται για το 96% των περιπτώσεων μη βακτηριακής οξείας επιδημικής γαστρεντερίτιδας. Σήμερα, η ιογενής γαστρεντερίτιδα είναι σε γενικές γραμμές καλά τεκμηριωμένη στις περισσότερες ανεπτυγμένες χώρες, σε αντίθεση με την Ελλάδα, όπου τα επιδημιολογικά στοιχεία που αφορούν την ιογενή γαστρεντερίτιδα Νοροϊικής προέλευσης εξακολουθούν να είναι ελλιπή. Για το λόγο αυτό στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκαν μελέτες, σε μοριακό επίπεδο, εντοπισμού και ελέγχου των κυκλοφορούντων Νοροϊικών στελεχών προκειμένου να παραχθούν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την εξέλιξη, την παθογένεια και την εξάπλωση των ιών αυτών στον πληθυσμό της κεντρικής Ελλάδος. Συλλέχθηκαν λύματα και κλινικά δείγματα από την κεντρική Ελλάδα και αναπτύχθηκαν τεχνικές, οι οποίες επέτρεψαν τον χαρακτηρισμό των Νοροϊικών στελεχών σε μοριακό επίπεδο, τεκμηρίωσαν δε τις μεταξύ τους γενετικές σχέσεις και κατέταξαν τα στελέχη σε γενετικό και γενοτυπικό επίπεδο. Το πρώτο στέλεχος Νοροϊών το οποίο χαρακτηρίσθηκε κατά την διάρκεια της παρούσας διατριβής απομονώθηκε από το κλινικό δείγμα Α6. Η ανίχνευση διεξήχθη αρχικά με την αντίδραση ELISA και ακολούθησε η ανίχνευση και ο μοριακός χαρακτηρισμός του εφαρμόζοντας RT-PCR και αλληλούχιση. Η μέθοδος RT-PCR που στόχευε στις συντηρημένες περιοχές του γονιδιώματος της GII γενετικής ομάδας, επέτρεψε τον χαρακτηρισμό του στελέχους A6 σε μοριακό επίπεδο και την ταξινόμηση του σε γενετικό και γενοτυπικό επίπεδο. Η φυλογενετική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με άλλα στελέχη της GII γενετικής ομάδας, τα οποία είχαν ήδη ομαδοποιηθεί σε γενότυπους. Με βάση την φυλογενετική ανάλυση της αλληλουχίας, το στέλεχος Α6 άνηκε στην GII γενετική ομάδα. Η μερική αλληλουχία του ORF1 γονιδίου και η πλήρης αλληλουχία του ORF2 γονιδίου έδειξαν ότι το ORF1 και το ORF2 ανήκαν σε δύο διαφορετικούς γενότυπους GII/9 και GII/6, αντίστοιχα, καθιστώντας προφανές ότι το στέλεχος A6 είναι ένα σπάνιο ανασυνδυασμένο στέλεχος εντός της GII γενετικής ομάδας μεταξύ των GII.9 και GII.6 γενότυπων αντίστοιχα. Στη συνέχεια, σε μια προσπάθεια μελέτης της κυκλοφορίας του ανασυνδυασμένου προαναφερθέντος στελέχους (Α6), πραγματοποιήθηκε έρευνα για την ύπαρξη Νοροϊών σε μη επεξεργασμένα λύματα, για το χρονικό διάστημα 2006-2011 και έγινε σύγκριση των αποτελεσμάτων με τους ιούς που ανιχνεύθηκαν από κλινικά δείγματα στην ίδια περιοχή και κατά την ίδια χρονική περίοδο. Χρησιμοποιήθηκαν δύο συγκεκριμένα ζεύγη εκκινητών τα οποία σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να ενισχύουν μία μοναδική αλληλουχία η οποία καλύπτει το σημείο του ανασυνδυασμού μεταξύ των ORF1/ORF2 γονιδίων. Με βάση την γενετική ανάλυση ταυτοποιήθηκαν δεκατέσσερα από τα δεκαπέντε περιβαλλοντικά και οκτώ από τα δέκα κλινικά δείγματα, επιβεβαιώνοντας ότι ο συγκεκριμένος ανασυνδυασμός κυκλοφορούσε στον πληθυσμό της κεντρικής Ελλάδας από το 2006 έως 2011. Το σημείο ανασυνδυασμούήταν εντός της περιοχής επικάλυψης των ORF1/ORF2 γονιδίων (GII.9/GII.6, αντίστοιχα) και προσδιορίστηκε με την χρήση του προγράμματος SimPlot στην ουκλεοτιδική θέση 5032 bp. Τέλος, τρία ακόμη στελέχη Νοροϊών ανιχνεύθηκαν σε κλινικά δείγματα που συλλέχθηκαν από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Ιωαννίνων τα οποία έφεραν σπάνιους ανασυνδυασμούς. Δύο δείγματα μεταξύ των GII.9/GII.4 γενοτύπων και ένα μεταξύ των GII.9/GI.7 γενετικών ομάδων. Επιπλέον ανιχνεύθηκε, ένα στέλεχος σε κλινικό δείγμα, το οποίο άνηκε στην GII γενετική ομάδα, στον γενότυπο τέσσερα, όπου μετά από τη φυλογενετική ανάλυση το στέλεχος αυτό σχημάτισε μονοφυλετικό κλάδο σε σχέση με τα υπόλοιπα GII.4 στελέχη.