Διερεύνηση της γαστρεντερίτιδος από norovirus στην Ελλάδα

Abstract

Norovirus is a member of the Caliciviridae family and constitutes the most frequent cause of endemic and epidemic viral gastroenteritis. It is classified in five genogroups, with several genotypes at each genogroup. The genogroups most frequently related with human infections are primary the GII and subsequently the GI, whereas the most widespread genotype is the GII.4. Norovirus has a worldwide distribution and infects all age groups. It is the second most frequent causative agent of viral gastroenteritis in children, following the rotavirus genus. Humans are the virus reservoir in nature. The virus is released in the environment mainly by patients' faeces as well as by vomits. Transmission is conducted through personal contact, contact with contaminated surfaces, food, water and aerosols. Seasonal distribution of the disease is questionable, but most researchers report a peak of the disease during the colder months of the year. Norovirus gastroenteritis is a mild and self-limited disease in healthy adults. More severe clinical manifestation occurs in children, in elderly people and people with underlying health problems, while no long-term complications have been observed. There is no vaccine for the disease, while immunity is generally short-term and strain-specific. Economical losses due to the disease are important worldwide. The knowledge of the epidemiology of norovirus in Greece is extremely limited. The purposes of the present thesis were: a) The determination of the incidence of the disease in Greece based mainly on cases of the Thessaloniki Infectious Diseases Hospital (TIDH), b) The seasonal and age distribution of the disease, c) The study of basic haematological and biochemical parameters (serum urea, potassium and sodium) in patients with norovirus infection, d) The study of the molecular epidemiology of the virus, by genetic characterization and phylogenetic analysis of norovirus strains, which were circulating in Greece during the study period, compared to norovirus strains that have been reported in other countries, e) The investigation of possible carriage of the virus in clinically healthy adults. During September 2005 to October 2006, 460 faeces samples from patients (318 children, 142 adults - 233 males, 227 females) of the TIDH with acute non bacterial gastroenteritis were tested for norovirus infection. Among them 456 were related to sporadic cases while 4 were derived from within family outbreaks. Four additional samples were tested taken from patients who became ill during a waterborne norovirus outbreak which occurred in the city of Xanthi in January 2005. Fifty faeces samples from healthy adults who were presented in TIDH for issue of a health certificate were also included in the study as control group. Two diagnostic RT-PCRs, which targeted the viral RNA-dependent RNA polymerase, namely RT-PCR-A and RT-PCR-B, as well as a commercially available EIA with polyclonal and monoclonal antibodies against the virus were performed on all samples, while a multiplex RT-PCR targeted the viral capsid VP1 region was applied on the positive samples (by at least with one of the three methods mentioned above). The purpose of the multiplex RT-PCR was the genotype determination of the norovirus strains and their phylogenetic analysis. Phylogenetic analysis was performed by the neighbor-joining method using the Phylip software. In total norovirus was detected in 51/460 (11.09%) faeces samples. All positive samples were derived from sporadic cases, and from the 4 cases related with the outbreak in Xanthi. No carriage of the virus was observed in the healthy adults control group. Norovirus was detected during the whole study period presenting two peaks, one in the winter and one in the summer. The virus infected people of all age groups (ranging from 11 months to 80 years old) without a certain trend with regards to age. Both sexes were equally affected. Genogroup determination was achieved for 39 out of 51 strains (76.47%), 38 belonged to the Gil genogroup (97.44%) and 1 to the Gl genogroup (2.56%). All strains from the Xanthi outbreak belonged to the GI genogroup. Phylogenetic analysis of 20 strains from the sporadic cases resulted in the following data: 1 (5%) belonged to the GI.1 genotype, 2 (10%) to the GII.2, 14 (70%) to the GII.4 and 3 (15%) to the GII.7. All strains from the Xanthi outbreak were genetically identical and belonged to the GI.1 genotype. The norovirus strains which occurred in Northern Greece during the period 2005-2006 were found to present high genetic similarity to strains detected worldwide. Implementation of the diagnostic tests has resulted in the following conclusions: EIA presented the highest sensitivity (87.3%) for the detection of norovirus strains among all diagnostic tests used. As EIA presents also optimal specificity, it is proposed as a first choice test for diagnosis of norovirus infections in cases when molecular study of the virus is not of any interest. Multiplex RT-PCR is highly sensitive (78.2%) for strains of both genogroups (GI and GII), being the only molecular method able to detect both genogroups. Thus, multiplex RT-PCR is proposed as the most appropriate molecular method for the detection of norovirus strains, which has also the advantage of providing PCR products which can be used for the phylogenetic analysis of the strains. RTPCR-A is proposed as an alternative test for the investigation of viral gastroenteritis outbreaks, especially in the case that EIA and multiplex RT-PCR provide a negative result. RT-PCR-B can be utilized as a first-choice diagnostic test for detection of norovirus infection, when investigating sporadic gastroenteritis cases. In conclusion, the application of serologic and molecular methods showed that noroviruses are related with many gastroenteritis cases in Greece. During the study period four norovirus genotypes (GI.1, GII.2, G1I.4, and GII.7) were circulating in Greece, with the majority of them belonging to the Gil.4 genotype, while a strain of genotype GI.1 caused a norovirus outbreak in a city of Northern Greece.

Ο νοροϊός ανήκει στην οικογένεια των καλυκοϊών και αποτελεί το συχνότερο αίτιο ενδημικής και επιδημικής ιογενούς γαστρεντερίτιδας. Ταξινομείται σε πέντε γενοομάδες, καθεμία από τις οποίες περιλαμβάνει διάφορους γονοτύπους του ιού. Η συχνότερη γενοομάδα, η οποία σχετίζεται με λοίμωξη του ανθρώπου είναι η GII και ακολουθεί η GI. Ο γονότυπος με την πιο ευρεία διασπορά είναι ο GII.4. Ο νοροϊός έχει παγκόσμια διασπορά και προσβάλλει όλες τις ηλικίες. Στα παιδιά αποτελεί το δεύτερο σε συχνότητα αίτιο ιογενούς γαστρεντερίτιδας, μετά το ροταϊό. Η δεξαμενή του ιού στη φύση είναι ο άνθρωπος. Ο ιός αποβάλλεται στο περιβάλλον κυρίως με τα κόπρανα των ασθενών αλλά και με τα εμέσματα. Η μετάδοση γίνεται με την προσωπική επαφή, με επαφή με μολυσμένες επιφάνειες, τροφιμογενώς, υδατογενώς αλλά και αερογενώς με μολυσμένα μικροσταγονίδια. Η εποχιακή κατανομή της νόσου είναι αμφισβητούμενη. Από τους περισσότερους ερευνητές ωστόσο αναφέρεται ως νόσος με εξάρσεις κυρίως κατά τους ψυχρούς μήνες του έτους. Η γαστρεντερίτιδα από το νοροϊό είναι ήπια και αυτοπεριοριζόμενη όταν προσβάλλει υγιείς ενήλικες. Σοβαρότερη κλινική εκδήλωση εμφανίζεται στα παιδιά, στους ηλικιωμένους και σε άτομα με υποκείμενα προβλήματα υγείας, ενώ μακροχρόνιες επιπλοκές δεν εμφανίζονται. Εμβόλιο για τη νόσο δεν υπάρχει, η δε ανοσία γενικά είναι βραχυχρόνια και ειδική για το εκάστοτε στέλεχος. Οι οικονομικές επιπτώσεις εξαετίας της νόσου παγκοσμίως είναι σημαντικές. Η επιδημιολογία του νοροϊού στην Ελλάδα είναι πρακτικά άγνωστη. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν: α) Ο προσδιορισμός της συχνότητας του νοροϊού ως αιτίου πρόκλησης γαστρεντερίτιδας στην Ελλάδα με βάση περιστατικά του Νοσοκομείου Ειδικών Παθήσεων Θεσσαλονίκης (ΝΕΠΘ, Λοιμωδών), β) Ο προσδιορισμός της εποχιακής και της ηλικιακής κατανομής των περιστατικών της νόσου, γ) Η μελέτη βασικών αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων (ουρία, κάλιο και νάτριο ορού) των ασθενών με λοίμωξη από νοροϊό, δ) Η μελέτη της μοριακής επιδημιολογίας του ιού, με το μοριακό χαρακτηρισμό και τη φυλογενετική ανάλυση των στελεχών νοροϊού, τα οποία θα εντοπίζονταν κατά τη διάρκεια της μελέτης στην Ελλάδα, σε σύγκριση με στελέχη νοροϊού που εντοπίστηκαν κατά τα προηγούμενα έτη στην Ευρώπη και σε άλλες περιοχές ε) Ο έλεγχος της ύπαρξης φορίας του ιού σε ομάδα ελέγχου υγιών ενηλίκων. Κατά το χρονικό διάστημα Σεπτεμβρίου 2005 - Οκτωβρίου 2006, ελέγχθηκαν για λοίμωξη από νοροϊό 460 δείγματα κοπράνων από ασθενείς (318 παιδιά/142 ενήλικες, 233 άρρενες ασθενείς/227 θήλεις ασθενείς) του ΝΕΠΘ με οξεία μη βακτηριακή γαστρεντερίτιδα. Τα 456 δείγματα προέρχονταν από σποραδικά κρούσματα ενώ τα 4 από δυο περιπτώσεις ενδοοικογενειακών επιδημιών. Επιπλέον, μελετήθηκαν και 4 δείγματα κοπράνων από ασθενείς που νόσησαν κατά τη διάρκεια υδατογενούς επιδημίας από νοροϊό, η οποία είχε εκδηλωθεί στην πόλη της Ξάνθης, τον Ιανουάριο του 2005. Τέλος, στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν και 50 δείγματα κοπράνων από υγιείς ενήλικες, οι οποίοι προσήλθαν στο ΝΕΠΘ για έκδοση πιστοποιητικού υγείας. Σε όλα τα δείγματα εφαρμόστηκαν δύο διαγνωστικές RT-PCR, η RT-PCR-A και η RT-PCR-B, με γονιδιακό στόχο από την περιοχή του γονιδίου της πολυμεράσης, και μια εμπορικά διαθέσιμη ανοσοενζυμική μέθοδος με πολυκλωνικά και μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του ιού. Σε όλα τα θετικά δείγματα (με οποιαδήποτε από τις τρεις μεθόδους), εφαρμόστηκε επιπλέον μία multiplex RT-PCR με γονιδιακό στόχο από την περιοχή του καψιδίου του ιού, με σκοπό τον προσδιορισμό της γενοομάδας των στελεχών και τη φυλογενετική τους ανάλυση. Η φυλογενετική ανάλυση έγινε με τη χρήση του προγράμματος Phylip, με τη μέθοδο neighbor-joining. Συνολικά νοροϊός ανιχνεύτηκε σε 51/460 (11,09%) δείγματα κοπράνων. Όλα τα θετικά δείγματα προέρχονταν από σποραδικά κρούσματα. Επίσης και τα 4 δείγματα κοπράνων από την επιδημία της Ξάνθης ήταν θετικά για τον ιό. Δεν παρατηρήθηκε φορία στην ομάδα ελέγχου των υγιών ατόμων. Λοίμωξη από τον ιό εμφανίστηκε σε όλη τη χρονική διάρκεια της μελέτης με δυο εξάρσεις, μια χειμερινή και μια θερινή. Βρέθηκε ότι ο ιός προσέβαλε άτομα όλων των ηλικιών (από 11 μηνών έως 80 ετών) χωρίς να παρουσιαστεί ιδιαίτερη συσχέτιση με κάποια ηλικιακή ομάδα. Τα δυο φύλα βρέθηκε ότι προσβλήθηκαν με την ίδια συχνότητα. Η γενοομάδα προσδιορίστηκε σε 39 από τα 51 στελέχη (76,47%), 38 στελέχη ανήκαν στη γενοομάδα GII (97,44%) και ένα στέλεχος στη γενοομάδα GI (2,56%). Τα στελέχη της επιδημίας της Ξάνθης ήταν όλα γενοομάδας GI. Από τη φυλογενετική ανάλυση 20 στελεχών από τα σποραδικά κρούσματα προέκυψε ότι: 1 (5%) στέλεχος ήταν γονοτύπου GI.1, 2 (10%) GII.2, 14 (70%) GII.4 και 3 (15%) GII.7, ενώ τα στελέχη από την επιδημία της Ξάνθης ήταν όλα γενετικά ταυτότσημα και ανήκαν στο γονότυπο GI.1. Τα στελέχη του νοροϊού, τα οποία παρατηρήθηκαν στη Βόρεια Ελλάδα κατά τη χρονική περίοδο 2005-2006 βρέθηκε ότι παρουσιάζουν μεγάλη γενετική συγγένεια με στελέχη, τα οποία εμφανίζουν παγκόσμια διασπορά. Από την εφαρμογή των διαγνωστικών μεθόδων προέκυψαν τα ακόλουθα συμπεράσματα: Η EIA παρουσιάζει τη μεγαλύτερη ευαισθησία (87,3%) για το σύνολο των στελεχών του νοροϊού από τις διαγνωστικές μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν. Για το λόγο αυτό, αλλά και σε συνδυασμό και με την άριστη ειδικότητά της, προτείνεται ως εξέταση πρώτης επιλογής για τη διάγνωση της λοίμωξης από νοροϊό, ειδικά στις περιπτώσεις που δεν ενδιαφέρει η μοριακή μελέτη του ιού. Στο σύνολο των στελεχών του νοροϊού, η multiplex RT-PCR είχε μεγάλη ευαισθησία (78,2%) και ήταν η μόνη από τις τρεις RT-PCR της μελέτης, με την οποία ανιχνεύθηκαν στελέχη και των δύο γενοομάδων (GI και GII). Για τους λόγους αυτούς προτείνεται ως η καταλληλότερη μοριακή μέθοδος της μελέτης για την ανίχνευση των στελεχών νοροϊού. Επιπλέον έχει το πλεονέκτημα ότι το προϊόν της είναι κατάλληλο για τη φυλογενετική ανάλυση και μελέτη του ιού. Η RT-PCR-A προτείνεται ως εναλλακτική εξέταση στην περίπτωση διερεύνησης επιδημιών γαστρεντερίτιδας ύποπτων για ιογενή αιτιολογία, εφόσον η EIA και η multiplex RT-PCR αποβούν αρνητικές. Η RT-PCR-B μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστική εξέταση πρώτης επιλογής για τη λοίμωξη από νοροϊό σε περιπτώσεις διερεύνησης σποραδικών κρουσμάτων οξείας γαστρεντερίτιδας. Συμπερασματικά, η εφαρμογή ανοσοενζυμικών και μοριακών μεθόδων έδειξε ότι ο νοροϊός ευθύνεται για πολλά περιστατικά γαστρεντερίτιδας στην Ελλάδα. Κατά το διάστημα της μελέτης ανιχνεύτηκαν στελέχη, τα οποία ανήκαν σε 4 γονοτύπους (GI.1, GII.2, GII.4 και GII.7), με την πλειονότητα των σποραδικών στελεχών να ανήκουν στο γονότυπο GII.4, ενώ ένα στέλεχος γονοτύπου GI.1 προκάλεσε επιδημική έξαρση της νόσου σε πόλη της Βόρειας Ελλάδας.