Μοριακοί μηχανισμοί της αγγειογένεσης: γονιδιακή ρύθμιση από τον αγγειογενετικό παράγοντα VEGF στα ενδοθηλιακά κύτταρα

Abstract

Vascular Endothelial Growth Factors (VEGFs) are the most important regulators of vessel morphogenesis. They not only participate in the regulation of both vasculogenesis and angiogenesis, but also are among the most important molecules involved in the pathogenesis of angiogenic diseases. Over-expression of VEGFs plays an important role in initiating pathological angiogenesis by altering the balance between angiogenic stimulators and inhibitors. In tumours, for instance, VEGFs are over-expressed playing a significant role in tumour progonosis and influencing the therapeutic strategy. VEGF ligands bind to three receptor tyrosine kinases (RTKs), known as VEGFR1-3, in order to transducer their signal and modify the transcriptional output. In the present study, the expression pattern of approximately 22000 genes was examined in the presence of VEGF-A in endothelial cells. Among the genes that were regulated by VEGF-A, Dual Specificity Phosphatases 1 and 5 (DUSP1 and DUSP5) mRNAs were dramatically induced following VEGF-A administration. DUSPs have been identified as specific regulators of the magnitude and duration of MAPK activation, since they are able to dephosphorylate both phospho-Tyr and phospho-Thr in the TXY-motif of MAPKs. We show here that DUSP1 was present in the nucleus, cytoplasm and plasma membrane, whereas DUSP5 is exclusively nuclear in endothelial cells. We next addressed the effect of VEGF on DUSP1 protein levels. VEGF induced the level of DUSP1 protein reaching a maximum at 2h and weakly declining thereafter. However, experiments with protein inhibitor revealed that VEGF also induces DUSP1-degradation. Thus, the concentration of VEGF-induced DUSP1 is a reflection of the balance between protein synthesis, following transcriptional enhancement of DUSP1 gene, and proteolytic degradation occurring because of MAPKs and DUSP1 interaction. As MAPKs are key molecules in signal transduction of VEGF, we examined the potential consequences of transcriptional induction ofDUSP1 and DUSP5 genes by VEGF-A in endothelial cells.. Towards this purpose, we have infected endothelial cells with adenoviruses expressing either wild type DUSP1 and DUSP5 or the dominant negative (catalytically inactive) forms these phosphatases and evaluated their effect on VEGF-A induced phosphorylation of p38 and ERK1/2 MAPKs. Our data indicate that DUSP1 is the main, if not the only, DUSP that regulates VEGF-A-induced phosphorylation of p38 MAPK. DUSP5 plays a significant role in the inactivation of VEGF-induced phosphorylation of ERK1/2, however, additional phosphatases may also contribute to this regulation. Moreover, DUSP5 has a strong nuclear anchoring activity on EPK1/2, thereby, accumulating inactive ERK1/2 in the nucleus of endothelial cell. Thus, DUSP5 sequesters ERK1/2 away from its cytoplasmic activator MEK1/2 rendering it an-available for further phosphorylation, contributing to the termination of SRK1/2 signalling. In accordance to the above results, we have shown that DUSP1 is able to regulate VEGF-A-induced migration of endothelial cells, whereas, DUSP5 is the main phosphatase involved in the VEGF-A-induced proliferation of endothelial cells. Finally, we tested possible interactions between the DUSPs and MAPKs in living endothelial cells. Experiments using fluorescence lifetime imaging (FLIM) and fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) revealed that DUSP1 and DUSP5 interact with p38 and ERK2, respectively. Moreover, we have evaluated the strength of the interaction by measuring the dissociation constant (Kd) of DUSPl/p38 and DUSP5/ERK2 interactions and the influence of VEGF-A administration on it. VEGF-A affects differently the Kds indicating that DUSPl/p38 and DUSP5/ERK1/2 have different fate after VEGF-A administration. The kinetics of the Kd of DUSP5/ERK1/2 interaction is compatible with the nuclear anchoring activity of DUSP5 on inactive ERK1/2. In conclusion, VEGF-A-induction of DUSP1 and DUSP5 serves as an auto-regulatory circuit that controls activation of ERK1/2 and p38 MAPK cascades by the same growth factor, thereby regulating angiogenic responses of ECs, such a proliferation and migration.

Τα μέλη της οικογένειας του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) αποτελούν τους πιο σημαντικούς παράγοντες στην αγγειακή διαφοροποίηση και αγγειογένεση. Η υπερέκφραση του VEGF παίζει σημαντικό ρόλο στην δημιουργία παθολογικής αγγειογένεσης ανατρέποντας την ισορροπία διεγερτών και αναστολέων της. Πράγματι, οι περισσότεροι καρκίνοι εκφράζουν σε υψηλά επίπεδα το mRNA του VEGF-A, γεγονός το οποίο έχει σημαντική προγνωστική σημασία για την έκβαση του όγκου και επηρεάζει τις θεραπευτικές επιλογές. Οι υποδοχείς του VEGF-A έχουν δραστικότητα τυροσινικής κινάσης και φωσφορυλιώνουν δευτερογενείς διαμεσολάβητες, οι οποίοι μετάγουν το σήμα στον πυρήνα, όπου και τροποποιούν το μεταγραφικό πρόγραμμα. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας ελέγχθηκε η έκφραση 22,000 γονιδίων σε ενδοθηλιακά κύτταρα παρουσία VEGF-A. Μεταξύ των γονιδίων που ρυθμίστηκαν από τον VEGF-A, αναγνωρίστηκαν για πρώτη φορά δύο φωσφατάσες διπλής εξειδίκευσης (Dual Specificity Phosphatases, DUSPs), οι DUSP1 και DUSP5. Οι DUSPs ρυθμίζουν τη δραστικότητα των MAP κινασών μέσω αποφωσφορυλίωσης του «ΤΧΥ-μοτίβου» και παρουσιάζονται ως ιδιαιτέρως αρνητικοί ρυθμιστές της σηματοδότησης των MAP κινασών. Δείξαμε ότι η DUSP1 εντοπίζεται στον πυρήνα, στο κυτταρόπλασμα και στη μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων ενώ η DUSP5 είναι αποκλειστικά πυρηνική πρωτεΐνη. Στη συνέχεια μελετήσαμε την επίδραση του VEGF-A στα πρωτεϊνικά επίπεδα της DUSP1. Ο VEGF-A προκάλεσε την αύξηση της πρωτεΐνης DUSP1 φτάνοντας στο μέγιστο επίπεδο μετά από 2 ώρες και παρουσιάζοντας μία ασθενή ύφεση στη συνέχεια. Ωστόσο, πειράματα με αναστολέα της πρωτεϊνοσύνθεσης έδειξαν ότι η παρουσία του VEGF-A επιτάχυνε και την αποδόμηση της DUSP1. Έτσι λοιπόν μπορούμε να καταλήξουμε στο συμπέρασμα ότι τα πρωτεϊνικά επίπεδα της DUSP1 μετά την προσθήκη του VEGF-A είναι το αποτέλεσμα της ισορροπίας μεταξύ της πρωτεϊνοσύνθεσης, η οποία ακολουθεί τη μεταγραφική επαγωγή του γονιδίου DUSP1, και της πρωτεολυτικής αποδόμησης που ακολουθεί την αλληλεπίδραση των ΜΑΡΚ με την DUSP1. Καθώς οι ΜΑΡΚ αποτελούν βασικά μόρια στη σηματοδότηση από τον VEGF-A, ελέγξαμε τον πιθανό ρόλο της μεταγραφικής ενεργοποίησης των DUSP1 και DUSP5 από τον VEGF στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό μολύναμε ενδοθηλιακά κύτταρα με αδενοϊους που εκφράζουν είτε τις αγρίου τύπου DUSP1 and DUSP5 είτε τις καταλυτικά ανενεργές (αρνητικά επικρατούσες) μορφές αυτών και ελέγξαμε την επίδρασή τους στην από τον VEGF-A επαγόμενη φωσφορυλίωση των ρ38 και ERK1/2 ΜΑΡΚ. Τα πειραματικά δεδομένα προβάλλουν την DUSP1 ως κύρια, αν όχι τη μόνη, φωσφατάση διπλής εξειδίκευσης για τη ρύθμιση της από τον VEGF επαγόμενης φωσφορυλίωσης της ρ38 ΜΑΡΚ στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η DUSP5 παίζει σημαντικό ρόλο στην αποφωσφορυλίωση των φωσφο-ΕΙΙΚ1/2, αν και η συνεισφορά και άλλων φωσφατασών θεωρείται πιθανή. Ωστόσο, η DUSP5 προκαλεί έντονη πυρηνική αγκυροβόληση και συσσώρευση των απενεργοποιημένων ERK1/2 στον πυρήνα των ενδοθηλιακών κυττάρων. Με τον τρόπο αυτό η DUSP5 αποσύρει τις ERK1/2 από τους κυτταροπλασματικούς διεγέρτες ΜΕΚ1/2, έτσι ώστε να μην είναι διαθέσιμες για παραπέρα ενερφοποίηση από τον VEGF-A συνεισφέροντας στο τερματισμό της μετάδοσης σήματος από τις ERK1/2 ΜΑΡΚ. Σε συμφωνία με τη ρύθμιση της δραστικότητας των ΜΑΡΚ από τις DUSPs δείξαμε ότι η DUSP1 παίζει καθοριστικό ρόλο στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων ενώ η DUSP5 ρυθμίζει τον επαγόμενο από τον VEGF-A κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Τέλος, εξετάσαμε τις πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ΜΑΡΚ και DUSP σε ζωντανά ενδοθηλιακά κύτταρα. Πειράματα μικροσκοπίας απεικόνισης χρόνου ζωής φθορισμού (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM) και φασματοσκοπίας σχετικού συσχετισμού φθορισμού (Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy (FCCS) έδειξαν ότι οι φωσφατάσες DUSP1 και DUSP5 αλληλεπιδρούν με τις ΜΑΡΚ ρ38 και ERK2, αντίστοιχα. Επιπλέον, εκτιμήθηκε η ισχύς των αλληλεπιδράσεων DUSPl/p38 και DUSP5/ERK2 μετρώντας την σταθερά διάστασης (Kd) τους, αλλά και η επίδραση της χορήγησης του VEGF-A στην Kd. Η παρουσία του VEGF-A επηρεάζει με διαφορετικό τρόπο τις παραπάνω αλληλεπιδράσεις στον πυρήνα των ενδοθηλιακών κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα σύμπλοκα DUSPl/p38 και DUSP5/ERK2 συμπεριφέρονται διαφορετικά μετά από την επαγωγή των κυττάρων. Στην περίπτωση της αλληλεπίδρασης DUSP5/ERK2 η κινητική της Kd στον πυρήνα των ενδοθηλιακών κυττάρων μετά από χορήγηση VEGF-A είναι συμβατή με την πυρηνικής αγκυροβόληση που εξασκεί η DUSP5 στην ERK1/2. Καταλήγουμε, λοιπόν, στο συμπέρασμα ότι η επαγωγή των DUSP1 και DUSP5 φωσφατασών από τον VEGF-A χρησιμοποιείται ως μηχανισμός αυτορύθμισης που ελέγχει το βαθμό ενεργοποίησης των σηματοδοτικών καταρρακτών των ERK1/2 και ρ38 ΜΑΡΚ από τον ίδιο αυξητικό παράγοντα και ως εκ τούτου τη ρύθμιση των αγγειογενετικών αποκρίσεων των ενδοθηλιακών κυττάρων, όπως ο πολλαπλασιασμός και η μετανάστευση.