Αξιολόγηση της προγνωστικής σημασίας των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης ασθενών με πρώιμο καρκίνο μαστού

Abstract

Background — the detection of CK-19 mRNA-positive circulating tumor cells (CTC) beforeand/or after adjuvant chemotherapy in patients with operable breast cancer is associatedwith poor clinical outcome. Reliable prognostic markers for late disease relapse are notavailable. In this study we investigated the value of CTC detection during the first 5 years offollow-up in predicting late disease relapse.Patients and Methods — blood was analyzed from 312 women with operable breastcancer who had not experienced disease relapse during the first two years of follow-up. Areal-time RT-PCR for CK-19 mRNA was used for CTC detection three months after thecompletion of adjuvant chemotherapy and every six months thereafter for a 5-year follow-upperiod.Results — eighty (25.6 percent) patients remained CTC-free throughout the 5-year period.A change in CTC status was observed in 133 (42.6 percent) patients; 64 (20.5 percent)patients with initially CK-19 mRNA-positive CTC during the first 24 months turned CTCnegativeafterwards while 69 (22.1 percent) who were initially CTC-negative became CTCpositive.Ninety-nine (31.7 percent) patients remained persistently CK-19 mRNA-positive.After a median follow-up period of 107 months (range: 38-161 months), the persistentlyCTC-positive patients with either hormonal receptor positive or negative tumors, had ahigher risk of late disease relapse compared to the persistently CTC-negative patients (36.4percent versus 11.2 percent, p<0.001). Multivariate analysis revealed that persistentlyCTC-positive patients also had a shorter disease-free (p=0.001) and overall survival(p=0.001).Conclusion — persistent detection of CK-19 mRNA-positive CTC during the first 5 years offollow-up is associated with an increased risk of late relapse and death for patients withoperable breast cancer, indicating the presence of chemotherapy- and hormonotherapyresistantresidual disease. This prognostic evaluation may be useful when deciding onsubsequent adjuvant systemic therapy.

Εισαγωγή: Ο διηθητικός καρκίνος του μαστού είναι η πιο συχνή κακοήθεια στις γυναίκες,αντιπροσωπεύοντας το 28% των νέων περιπτώσεων καρκίνου και το 15% των θανάτωναπό καρκίνο. Λόγω της μείωσης των ποσοστών θνησιμότητας, τα οποία οφείλονται στηνευρεία εφαρμογή του προσυμπτωματικού ελέγχου με μαστογραφία και στην επικουρικήθεραπεία, περισσότερες γυναίκες επιβιώνουν στις μέρες μας από τη νόσο. Δεδομένου ότι ημεταστατική νόσος θεωρείται ανίατη, η έγκαιρη αναγνώριση και θεραπεία της δυνητικάακόμα ιάσιμης ελάχιστης υπολειπόμενης νόσου είναι ένας από τους σημαντικότερουςστόχους της κλινικής έρευνας των ασθενών και προϋποθέτει την κατανόηση σε βάθος τωνπροτύπων υποτροπής.Η παρουσία καρκινικών κυττάρων στο μυελό των οστών και κυκλοφορούντωνκαρκινικών κυττάρων (ΚΚΚ) στο περιφερικό αίμα των ασθενών με πρώϊμο καρκίνο τουμαστού έχουν αποδειχθεί ως ανεξάρτητοι δυσμενείς προγνωστικοί παράγοντες γιαυποτροπή και θάνατο από τη νόσο. Η ανοσοκυτταροχημεία με τη χρηση αντισωμάτωνέναντι πρωτεϊνών που εκφράζονται σε επιθηλιακά αλλά όχι σε μεσεγχυματικά κύτταραχρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση των ΚΚΚ. Ωστόσο, η ανίχνευση της γονιδιακήςέκφρασης συγκεκριμένων επιθηλιακών δεικτών με τη χρήση qPCR φαίνεται να έχει υψηλότερη διαγνωστική ευαισθησία.Η κυτταροκερατίνη-19 (Cytokeratin-19, CK-19) έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τηνανίχνευση των καρκινικών κυττάρων του μαστού σε μεσεγχυματικούς ιστούς και φαίνεται ναείναι ευαίσθητος και αξιόπιστος βιοδείκτης σε ασθενείς με πρώϊμη και μεταστατική νόσο.Αρκετές μελέτες έχουν δείξει την προγνωστική σημασία της ανίχνευσης CK-19 mRNA-θετικών ΚΚΚ σε ασθενείς με πρώϊμο καρκίνο του μαστού. Ωστόσο, σε όλες αυτές τις μελέτεςέχει μελετηθεί η προγνωστική αξία των ΚΚΚ κατά την αρχική διάγνωση και πριν από τηνέναρξη ή/και μετά την ολοκλήρωση της συμπληρωματικής χημειοθεραπείας. Μόνο λίγαδεδομένα υπάρχουν σχετικά με την κλινική σημασία της ανίχνευσης καρκινικών κυττάρωνστο μυελό των οστών, αλλά καμία για τα ΚΚΚ κατά τη διάρκεια της περιόδουπαρακολούθησης μετά την ολοκλήρωση της συμπληρωματικής χημειοθεραπείας. Οιμελέτες αυτές ανέδειξαν την δυσμενή κλινική έκβαση των ασθενών με ανιχνεύσιμα κύτταρατου όγκου στο μυελό των οστών. Στην παρούσα μελέτη, επιδιώξαμε να αξιολογήσουμε την κλινική σημασία τηςανίχνευσης των CK-19 mRNA-θετικών ΚΚΚ με την εφαρμογή RT-qPCR σε διαφορετικάχρονικά σημεία κατά την περίοδο παρακολούθησης μετά την ολοκλήρωση τηςσυμπληρωματικής χημειοθεραπείας, σε ασθενείς με πρώϊμο καρκίνο του μαστού.Υποθέσαμε ότι οι ασθενείς που παρουσιάζουν ανιχνεύσιμο CK-19 mRNA κατά τη διάρκειατης παρακολούθησης, μετά τη χορήγηση επικουρικής θεραπείας έχουν αυξημένο κίνδυνοόψιμης υποτροπής της νόσου (υποτροπή τουλάχιστον δύο χρόνια μετά τη λήξη τηςσυμπληρωματικής χημειοθεραπείας) και θανάτου από τη νόσο.Ασθενείς – Μέθοδοι: Πραγματοποιήθηκε μια αναδρομική ανάλυση δεδομένων πουσυλλέχθηκαν προοπτικά στο πλαίσιο μιας συνεχιζόμενης μελέτης που έχει ξεκινήσει πρινπολλά χρόνια στο Εργαστήριο Βιολογίας του Καρκίνου. Γυναίκες με χειρουργήσιμο καρκίνοτου μαστού (στάδιο Ι έως ΙΙΙ), οι οποίες ήταν υπό παρακολούθηση και δεν είχανπαρουσιάσει υποτροπή της νόσου κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων ετών μετά το πέραςτης επικουρικής χημειοθεραπείας ήταν κατάλληλες για τη μελέτη. Μετά την ολοκλήρωση τηςσυμπληρωματικής χημειοθεραπείας, οι ασθενείς έλαβαν συμπληρωματική ακτινοθεραπείακαι ορμονική θεραπεία σύμφωνα με τα χαρακτηριστικά της νόσου. Η εξέταση δειγμάτων για CK-19 mRNA-θετικών ΚΚΚ γίνονταν σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία μετά την ολοκλήρωσητης συμπληρωματικής χημειοθεραπείας για μια 5-ετή περίοδο παρακολούθησης. Το πρώτοδείγμα αίματος λαμβάνονταν 3 μήνες μετά το τέλος της χημειοθεραπείας και στη συνέχειακάθε 6 μήνες έως τη συμπλήρωση 5 ετών.Οι ασθενείς ταξινομήθηκαν σε τέσσερις ομάδες ανάλογα με την ανίχνευση ή όχι ΚΚΚκατά τα δύο πρώτα χρόνια και τα επόμενα τρία χρόνια παρακολούθησης (όπως επίμονααρνητική, επίμονα θετική, αρνητικό μετατροπή σε θετικό και το αντίθετο). Χρησιμοποιώνταςτον ορισμό αυτό, οι ασθενείς ταξινομήθηκαν στην "επίμονα ΚΚΚ-αρνητική" ομάδα, αν δενείχαν κανένα θετικό δείγμα αίματος για CK-19 mRNA σε όλη την 5-ετή περίοδοπαρακολούθησης. Από την άλλη πλευρά, η «επίμονα ΚΚΚ-θετική» ομάδα περιελάμβανεασθενείς με τουλάχιστον ένα θετικό δείγμα αίματος για CK-19 mRNA στα πρώτα 2 έτη καιτουλάχιστον άλλο ένα κατά τα επόμενα 3 χρόνια παρακολούθησης. Κατά συνέπεια, οιασθενείς στην "CTC-αρνητική/θετική" ομάδα δεν είχε θετικά δείγματα στα δύο πρώτα χρόνια,αλλά τουλάχιστον ένα θετικό δείγμα στα επόμενα 3 χρόνια. Το αντίθετο ίσχυε για την "CTC-θετική/αρνητική ομάδα.Είκοσι χιλιοστόλιτρα (ml) περιφερικού αίματος συλλέγονταν σε κάθε επίσκεψη σεσωληνάρια που περιείχαν EDTA. Για να αποφεύγεται η επιμόλυνση με τα επιθηλιακάκύτταρα από το δέρμα, όλα τα δείγματα αίματος λαμβάνονταν στα μέσα της παρακέντησηςφλέβας και αφού τα πρώτα 5 mL αίματος απορρίπτονταν. Μονοπύρηνα κύτταρα τουπεριφερικού αίματος λαμβάνονταν μετά από διαβαθμιζόμενη φυγοκέντρησηχρησιμοποιώντας Ficoll-Hypaque. Η απομόνωση του RNA γίνονταν με τη χρήση τωναντιδραστηρίων Trizol LS (Gibco-BRL, Grand Island, NY, Η.Π.Α.). Το απομονωμένο RNAδιαλύονταν σε diethylpyrocarbonate επεξεργασμένο νερό και αποθηκεύονταν στους -80°Cμέχρι να χρησιμοποιηθεί. Η αντίστροφη μεταγραφή του RNA γίνονταν με την μέθοδοThermoscript RT-PCR (Life Technologies-Invitrogen, Ηνωμένο Βασίλειο). Τοσυμπληρωματικό DNA (cDNA) συνθέτοταν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ημέθοδος RT-qPCR μέθοδος για την ανίχνευση της έκφρασης της CK-19 έχει περιγραφείπροηγουμένως.Η επιβίωση ελεύθερη νόσου (ΕΕΝ), η οποία ορίζεται ως ο χρόνος από την έναρξητης μελέτης μέχρι την ημέρα υποτροπής της νόσου και η συνολική επιβίωση (OΕ) πουμετριέται από την έναρξη της μελέτης μέχρι το θάνατο ανεξαρτήτως αιτιολογίας ήταν τα κύρια καταληκτικά σημεία της μελέτης. Κλινικοπαθολογοανατομικοί παράγοντες που είναιγνωστό ότι σχετίζονται με την πρόγνωση, όπως η εμμηνοπαυσιακή κατάσταση(προεμμηνοπαυσιακές vs μετεμμηνοπαυσιακές), το μέγεθος του όγκου (Τ1 vs Τ2-3), οαριθμός των διηθημένων μασχαλιαίων λεμφαδένων (0-3 vs ≥ 4), ο βαθμός διαφοροποίησης(grade: 1-2 vs 3), οι οιστρογονικοί υποδοχείς (ER) (αρνητικοί έναντι θετικών), οι υποδοχείςπρογεστερόνης (PR) (αρνητικοί έναντι θετικών) και η ενίσχυση του HER-2/neu (αρνητικόέναντι θετικού) εξετάστηκαν σε μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση.Αποτελέσματα: Συνολικά 455 διαδοχικοί ασθενείς με διάγνωση καρκίνου του μαστού πουαντιμετωπίστηκαν θεραπευτικά στην κλινική Παθολογικής-Ογκολογίας του ΠανεπιστημιακούΝοσοκομείου Ηρακλείου μεταξύ Ιανουαρίου 1997 και Δεκεμβρίου 2004 εξετάστηκαν για τηνένταξη τους στη μελέτη αυτή. Εκατόν σαράντα τρεις ασθενείς αποκλείστηκαν και 312συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Οι ασθενείς που βρέθηκαν θετικοί στην παρουσία ΚΚΚ δενδιέφεραν σε σχέση με όσες παρέμειναν αρνητικές σε ότι αφορά στα χαρακτηριστικά τους[ηλικία (p=0.197), εμμηνοπαυσιακή κατάσταση (p=0.372)] ή στα χαρακτηριστικά των όγκων τους [μέγεθος (p=0.637), διήθηση λεμφαδένων (p=0.082), ιστοπαθολογική διαφοροποίηση(p=0.746) και κατάσταση των ορμονικών υποδοχέων (p =0.156)].CK-19 mRNA-θετικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν σε 232 ασθενείς (74.4%) σεοποιοδήποτε χρονικό σημείο κατά τη διάρκεια της 5ετούς παρακολούθησης, ενώ 80ασθενείς (25.6%) παρέμειναν «αρνητικοί» καθ 'όλη την ίδια περίοδο (επίμονα αρνητικήομάδα). Πιο συγκεκριμένα, 99 ασθενείς (31.7%) είχαν επίμονα ανιχνεύσιμα CK-19 mRNA-θετικά κύτταρα τόσο κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων όσο και τα επόμενα τρία χρόνιαπαρακολούθησης (επίμονα θετική ομάδα). Μια αλλαγή του CK-19 mRNA παρατηρήθηκε σεσχεδόν μισές από τις ασθενείς (133 ασθενείς ή 42.6%). Από αυτές, 64 ασθενείς (20.5%) μεανιχνεύσιμα αρχικά CK-19 mRNA-θετικά κύτταρα κατά τη διάρκεια των πρώτων 24 μηνώνέγιναν «CTC αρνητικές» στη συνέχεια (θετική/αρνητική ομάδα), ενώ 69 ασθενείς (22.1%)που ήταν αρχικά «CTC αρνητικές» έγιναν «CTC θετικές» (αρνητική/θετική ομάδα).Μετά από μια διάμεση περίοδο παρακολούθησης 107 μηνών (εύρος: 38 - 161 μήνες),63 ασθενείς (20.2%) είχαν αναπτύξει απομακρυσμένη (n=56; 88.8%) ή τοπική υποτροπή(n=7; 11.2%) . Σε σύγκριση με την «επίμονα αρνητική» ομάδα ασθενών, μόνο η ομάδα των «επίμονα θετικών» είχε σημαντικά υψηλότερο κίνδυνο υποτροπής της νόσου (36.4% έναντι11.2%, p<.001). Στην πραγματικότητα, ο κίνδυνος επανεμφάνισης της νόσου ήτανυψηλότερος σε ασθενείς με επίμονα θετικά ΚΚΚ (36.4% έναντι 7.8%, p<0.001 και 36.4%έναντι 18.8%, p=0.016 σε σύγκριση με θετική/αρνητική και αρνητική/θετική ομάδα,αντίστοιχα).Τα ποσοστά 5-ετούς ΕΕΝ ήταν 82.5% έναντι 92.7% για τις επίμονα θετικές καιεπίμονα-αρνητικές ασθενείς, αντίστοιχα. Επιπλέον οι επίμονα θετικές ασθενείς είχανσημαντικά μικρότερη ΕΕΝ συγκριτικά με τις επίμονα αρνητικές ασθενείς (p<0.001). Παρά τογεγονός ότι καμία ομάδα δεν έχει φθάσει στη διάμεση ΕΕΝ, υπήρξε μια σταδιακή μείωσητης ΕΕΝ για τις τέσσερις ομάδες των ασθενών, σύμφωνα με την ανίχνευση των CK-19mRNA-θετικών ΚΚΚ κατά τα 5 χρόνια παρακολούθησης.Σαράντα-μία ασθενείς (13.1%) απεβίωσαν κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης,ως συνέπεια της εξέλιξης της νόσου. Είκοσι τέσσερις (58.5%) και πέντε (12.2%) από αυτούςτους θανάτους συνέβησαν στην επίμονα-θετική και επίμονα-αρνητική ομάδα, αντίστοιχα (p=0.001). Η 10-ετής συνολική επιβίωση ήταν 81.4% για τις επίμονα θετικές έναντι 96.7%για τις επίμονα αρνητικές ασθενείς. Η εκτιμώμενη διάμεση συνολική επιβίωση ήταν σημαντικά μικρότερη για τις επίμονα θετικές σε σύγκριση με τις επίμονα αρνητικές ασθενείς(p=0.013).Καθώς οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε σειρά μετρήσεων των CK-19 mRNA-θετικώνΚΚΚ, αναλύθηκαν τα δεδομένα για να απαντηθεί το ερώτημα αν το αθροιστικό αποτέλεσματων θετικών μετρήσεων ανά ασθενή προσφέρει επιπλέον προγνωστική πληροφορία.Μεταξύ των ασθενών με θετικές μετρήσεις 38.7% (κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων ετώντης παρακολούθησης), 24.4% (κατά τα επόμενα 3 έτη) και 57.3% (κατά τη διάρκεια όλωντων 5 ετών) είχαν δύο ή περισσότερα θετικά αποτελέσματα. Δεν βρέθηκε διαφορά στηνελεύθερη νόσου επιβίωση μεταξύ των ομάδων με διαφορετικό συνολικό αριθμό θετικώντεστ, πιθανώς λόγω του μικρού αριθμού των ασθενών και συμβάντων σε κάθε ομάδα.Δεδομένης της προγνωστικής σημασίας της ανίχνευσης των ΚΚΚ πριν από τηχορήγηση συμπληρωματικής χημειοθεραπείας, εξετάσθηκε το ερώτημα αν θα μπορούσε ναπροσφέρει πρόσθετη προγνωστική πληροφορία με αυτό της διαδοχικής μέτρησης των ΚΚΚκατά τη διάρκεια της παρακολούθησης. Για το σκοπό αυτό, μελετήθηκε η κατάσταση τωνΚΚΚ προ-χημειοθεραπείας, όλων των ασθενών που περιλαμβάνονται στην παρούσαανάλυση. Δεν προέκυψε διαφορά στο ποσοστό ανίχνευσης των CK-19 mRNA-θετικών ΚΚΚ μεταξύ των τεσσάρων ομάδων (Pearson Chi-square, p=0.320). Είναι ενδιαφέρον, ότι οι«επίμονα θετικές» ασθενείς με ανιχνεύσιμα CK-19 mRNA-θετικά ΚΚΚ πριν από τηχορήγηση συμπληρωματικής χημειοθεραπείας είχαν μικρότερη ΕΕΝ, αλλά όχι συνολικήεπιβίωση (OΕ) σε σύγκριση με τους ασθενείς της ίδιας ομάδας που βρέθηκαν αρνητικές γιαΚΚΚ σε μέτρηση πριν την έναρξη της χημειοθεραπείας.Τέλος, έγινε ανάλυση υποομάδων ανάλογα με την ορμονική κατάσταση τουπρωτοπαθούς όγκου. Είναι ενδιαφέρον, ότι η «επίμονα θετική» ομάδα ασθενών με όγκουςείτε θετικούς είτε αρνητικούς για ορμονικούς υποδοχείς είχαν σημαντικά υψηλότεροποσοστό υποτροπής, κίνδυνο θανάτου και μικρότερη ΕΕΝ συγκριτικά με τις «επίμονααρνητικές» ασθενείς (p=0.039 και p=0.004 για επίμονα θετικές vs επίμονα αρνητικέςασθενείς με ER/PR αρνητικούς και ER ή/και PR θετικούς όγκους, αντίστοιχα). Ωστόσο, ησυνολική επιβίωση ήταν μικρότερη μόνο για τις «επίμονα θετικές» ασθενείς με ER/PR αρνητικούς όγκους (p =0.035).Η επίμονη ανίχνευση των CK-19 mRNA-θετικών ΚΚΚ κατά τη διάρκεια τηςπαρακολούθησης μετά την ολοκλήρωση της συμπληρωματικής χημειοθεραπείας, το μέγεθος του όγκου μεγαλύτερο από 2.0 cm, η διήθηση περισσοτέρων από 3 μασχαλιαίωνλεμφαδένων και η μετεμμηνοπαυσιακή κατάσταση σχετίζονταν με σημαντικά μικρότερηΕΕΝ και ΟΕ σε μονοπαραγοντική ανάλυση. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι ηεπίμονη ανίχνευση των CK-19 mRNA-θετικών ΚΚΚ, το μέγεθος του όγκου και περισσότεροιαπό 3 διηθημένους μασχαλιαίους λεμφαδένες ήταν ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντεςγια μικρότερη ΕΕΝ και ΟΕ.Συμπέρασμα: Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν την πρώτη ένδειξη για την προβλεπτικήαξία της ανίχνευσης των CK-19 mRNA-θετικών ΚΚΚ κατά την παρακολούθηση ασθενώνπου ολοκλήρωσαν την τοπική θεραπεία και συστηματική χημειοθεραπεία. Τα ευρήματααυτά υποστηρίζουν το ρόλο της παρακολούθησης των ΚΚΚ, ως συμπλήρωμα του ιστορικού,της φυσικής εξέτασης και των ακτινολογικών μεθόδων για την αξιολόγηση της κατάστασηςτης νόσου κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης ασθενών με πρώιμο καρκίνο του μαστού