Συστημική αυτοανοσία, συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, νεφρίτιδα

Abstract

Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is the prototypic systemic autoimmune disease characterized by loss of tolerance to self-nuclear antigens, abnormal B and T cell responses and immune-complex deposition to multiple organs including the skin, joints, kidneys and nervous system. During the last years, mortality has decreased; however, it remains greater than that of the general population. SLE pathogenesis is complex and involves defective clearance of immune-complexes and debris containing nucleic acids, excessive innate immune activation involving Toll-like receptors (TLR) and type I interferons (IFN), and abnormal lymphocyte activation. Despite vigorous research its etiology remains elusive and is thought to result from the interaction of multiple genetic, epigenetic and environmental factors. The aim of the study was to further investigate SLE pathogenesis through a comparative transcriptomic analysis between NZB/W-F1 lupus-prone mice and C57BL/6 healthy mice, using next-generation sequencing technologies (RNA-sequencing).Female NZB/W-F1 lupus-prone mice were sacrificed with perfusion at the pre-puberty, pre-autoimmunity and nephritic stage of the disease. Age-matched C57BL/6 mice were used as healthy controls. A peripheral lymphoid organ (spleen) and target end-organs (kidneys and brain) were removed, and total RNA was extracted. Paired-end RNA-sequencing was performed with Illumina HiSeq 2000 platform. Sequencing reads were mapped to the reference genome. The relative expression levels of the transcripts and differentially expressed genes (DEGs) (FC>1.5, p<0.05) were calculated. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) was used to identify canonical pathways, upstream regulators and top up-regulated or down-regulated molecules. To investigate genetic susceptibility of SLE, a comparative transcriptome analysis was performed between same organs of NZB/W-F1 and C57BL/6 of the same age, at different stages of the disease. At the pre-puberty, pre-autoimmunity and nephritic stage of the disease, 693, 289 and 89 DEGs were identified in the spleen; 63, 930 and 21 DEGs were identified in the kidney; and 2, 2 and 5 DEGs were identified in the brain of lupus-prone vs healthy mice, respectively. To investigate tissue-specificity in SLE, a comparative transcriptome analysis between different organs of NZB/W-F1 lupus-prone mice of the same stage of the disease was performed. At the pre-puberty stage, 3304 DEGs were identified between the brain and the kidney; 4808 DEGs were identified between the brain and the spleen; and 3279 DEGs were identified between the kidney and the spleen of lupus-prone mice. At the pre-autoimmunity stage, 2036 DEGs were identified between the brain and the kidney; 4483 DEGs were identified between the brain and the spleen; and 1781 DEGs were identified between the kidney and the spleen of lupus-prone mice. At the nephritic stage, 3550 DEGs were identified between the brain and the kidney; 4810 DEGs were identified between the brain and the spleen; and 3267 DEGs were identified between the kidney and the spleen of lupus-prone mice. To investigate the developmental biology of SLE, a comparative transcriptome analysis was performed between same organs of the same mouse model at different stages of the disease. In the spleen, brain and kidney of NZB/W-F1 lupus-prone mice, 277, 6 and 8 DEGs were identified at the pre-puberty vs the pre-autoimmunity stage; 212, 6 and 8 DEGs were identified at the nephritic vs the pre-puberty stage; and 15, 6 and 2 DEGs were identified at the nephritic vs the pre-autoimmunity stage, respectively. At the nephritic stage of the disease, the extrinsic prothrombin activation pathway was identified both at the spleen and the kidneys of lupus-prone mice. It is known that in sepsis, tissue factor (TF) -the main in vivo initiator of the extrinsic pathway of the coagulation cascade, and at the same time a trigger of inflammation- is released on neutrophil extracellular traps (NETs). Using DNA and microRNA arrays, we have previously shown that patients with active SLE express a strong neutrophil and deregulated autophagy signature. In this study, we found that neutrophilic and autophagy-related genes were differentially expressed in the spleens of lupus-prone mice at all stages of the disease. We hypothesized that autophagy-dependent delivery of TF on NETs could represent a link between increased thrombogenicity and inflammation observed in SLE. The next aim of the study was to investigate the role of TF-decorated NETs in SLE.Serum and neutrophils from healthy donors and SLE patients (active and on treatment with hydroxychloroquine) were isolated. Cultures of ex vivo neutrophils, and in vitro stimulation or inhibition studies were performed. Autophagy levels were evaluated by confocal microscopy and immunoblotting. NET release was studied by confocal microscopy, NETs were measured by MPO-DNA complex ELISA in cell culture supernatants and in serum. TF and IL-17 expression was studied by confocal microscopy and immunoblotting. TF activity was measured with thrombin-antithrombin complex ELISA. Kidney biopsies from patients with proliferative lupus nephritis (LN) were examined with immunofluorescence for the presence of TF-decorated NETs and IL-17-decorated NETs. Finally, the effect of SLE NETs on human cultured podocytes was investigated. We found that neutrophils from patients with active SLE expressed increased autophagy levels and increased NETosis in an autophagy-dependent manner. NETs released from patients with active SLE were decorated with IL-17 and active TF leading to thrombin generation. Serum from patients with active SLE induced autophagy in healthy neutrophils and autophagy-dependent TF-decorated NET release, suggesting that the inflammatory environment of SLE mediates these processes. Treatment of patients with hydroxychloroquine -an autophagy inhibitor- reverses these phenomena. Importantly, TF- and IL-17-decorated NETs infiltrated the kidneys (both in the glomeruli and the tubulointerstitium) of patients with proliferative LN even in the absence of intact neutrophils within the kidney. Culture of human podocytes in the presence of active SLE NETs altered the morphology of the cells.In conclusion, this next-generation sequencing analysis of lupus-prone mice revealed a data-base of differentially expressed transcripts that characterize genetic susceptibility, tissue-specificity and developmental biology of SLE. These findings represent novel biomarkers of organ involvement and disease progression, and novel therapeutic targets in SLE. We also found that, in human SLE, NETs represent scaffolds with accumulated bioactive molecules such as TF and IL-17, that remain in target tissues even in the absence of intact neutrophils. Endothelin-1 and C5a represent the inflammatory mediators that activate the HIF-1/REDD1 pathway that increases autophagy in neutrophils mediating NETosis. TF- and IL-17-decorated NETs alter the morphology of cultured podocytes and mediate collagen production from fibroblasts. We described a multiple-hit model that needs a multitarget therapy that could be represented by repositioned drugs.

Ο Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος (ΣΕΛ) είναι το πρωτότυπο συστημικό χρόνιο αυτοάνοσο νόσημα που χαρακτηρίζεται από απώλεια ανοχής στα πυρηνικά αντιγόνα εαυτού, παθολογικές απαντήσεις Β και Τ λεμφοκυττάρων και εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων σε διάφορα όργανα όπως, δέρμα, αρθρώσεις, νεφρούς και νευρικό σύστημα. Τα τελευταία χρόνια η θνητότητα έχει βελτιωθεί όμως, ακόμα παραμένει υψηλότερη σε σχέση με τη θνητότητα του γενικού πληθυσμού. Η παθογένειά του είναι πολύπλοκη και, παρά τις εντατικές ερευνητικές προσπάθειες ακόμα παραμένει αδιευκρίνιστη. Θεωρείται ότι, ο ΣΕΛ προκαλείται από αλληλεπίδραση γενετικών, επιγενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων. Σκοπός της μελέτης ήταν η περαιτέρω διερεύνηση των παθογενετικών μηχανισμών του ΣΕΛ μέσω συγκριτικής μελέτης μεταγραφώματος των ζωικών προτύπων λύκου NZB/W-F1 και των υγιών προτύπων C57BL/6, χρησιμοποιώντας τεχνικές αλληλούχησης RNA νέας γενεάς (RNA-sequencing).Θηλυκά NZB/W-F1 ζωικά πρότυπα λύκου θυσιάστηκαν στο στάδιο προ-εφηβίας (κατά το οποίο απουσιάζουν οι ορμόνες του φύλου), στο στάδιο προ-αυτοανοσίας (κατά το οποίο απουσιάζουν τα αυτοαντισώματα) και στο στάδιο της νεφρίτιδας (όπου η πρωτεϊνουρία είναι>300mg/dl). Οι μύες C57BL/6 χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου. Αφαιρέθηκαν σπλήνας (περιφερικό λεμφικό όργανο), νεφροί και εγκέφαλος (τελικά όργανα-στόχοι) και, απομονώθηκε RNA. Ακολούθησε αλληλούχηση RNA νέας γενεάς στην πλατφόρμα Illumina HiSeq 2000. Υπολογίστηκαν επίπεδα έκφρασης RNA, διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια (ΔΕΓ) (FC>1.5, p<0.05) και, με το Ingenuity Pathway Analysis αναζητήθηκαν κανονικές οδοί, ανοδικοί ρυθμιστές και κυριότερα υπερεκφραζόμενα ή υποεκφραζόμενα μόρια. Για να μελετηθεί η γενετική ευπάθεια του ΣΕΛ, έγινε συγκριτική μελέτη μεταγραφώματος ίδιων οργάνων, μεταξύ NZB/W-F1 και C57BL/6, ίδιας ηλικίας, σε διαφορετικά στάδια του νοσήματος. Στα στάδια προ-εφηβίας, προ-αυτοανοσίας και νεφρίτιδας διαπιστώθηκαν στο σπλήνα 693, 289 και 89 ΔΕΓ, στο νεφρό 63, 930 και 21 ΔΕΓ και, στον εγκέφαλο 2, 2 και 5 ΔΕΓ, αντίστοιχα. Για να μελετηθεί η οργανοειδικότητα του ΣΕΛ στο χρόνο, έγινε συγκριτική μελέτη μεταγραφώματος διαφορετικών οργάνων των NZB/W-F1 υβριδίων λύκου κατά το ίδιο στάδιο του νοσήματος. Κατά το στάδιο της προ-εφηβίας, διαπιστώθηκαν 3304 ΔΕΓ μεταξύ του εγκεφάλου και του νεφρού, 4808 ΔΕΓ μεταξύ εγκεφάλου και σπλήνα και, 3279 ΔΕΓ μεταξύ νεφρού και σπλήνα. Κατά το στάδιο της προ-αυτοανοσίας διαπιστώθηκαν 2036 ΔΕΓ μεταξύ του εγκεφάλου και του νεφρού, 4483 ΔΕΓ μεταξύ εγκεφάλου και σπλήνα και, 1781 ΔΕΓ μεταξύ νεφρού και σπλήνα. Στο στάδιο της νεφρίτιδας, διαπιστώθηκαν 3550 ΔΕΓ μεταξύ εγκεφάλου και νεφρού, 4810 ΔΕΓ μεταξύ εγκεφάλου και σπλήνα και 3267 ΔΕΓ μεταξύ νεφρού και σπλήνα. Για να διαπιστωθεί η αναπτυξιακή βιολογία του ΣΕΛ έγινε συγκριτική μελέτη μεταγραφώματος ίδιων οργάνων, ίδιων ζωικών προτύπων, σε διαφορετικά στάδια του νοσήματος. Στο σπλήνα, στον εγκέφαλο και στο νεφρό των NZB/W-F1 υβριδίων λύκου διαπιστώθηκαν 277, 12 και 1 ΔΕΓ μεταξύ του σταδίου της προ-εφηβίας και του σταδίου της προ-αυτοανοσίας; 212, 6 και 8 ΔΕΓ μεταξύ του σταδίου της νεφρίτιδας και του σταδίου της προ-εφηβίας; και 15, 6 και 2 ΔΕΓ μεταξύ του σταδίου της νεφρίτιδας και του σταδίου της προ-αυτοανοσίας, αντίστοιχα. Για να επιλεγεί μία οδός προς περαιτέρω μελέτη, αναζητήθηκαν στα δεδομένα της ανάλυσης νέες κανονικές οδοί που συμμετέχουν στα ζωικά πρότυπα λύκου, τόσο στο περιφερικό λεμφικό όργανο όσο και σε τελικό όργανο-στόχο του νοσήματος. Στα ζωικά πρότυπα λύκου στο στάδιο της νεφρίτιδας διαπιστώνεται η συμμετοχή της κανονικής οδού της ενεργοποίησης της εξωγενούς οδού της πήξης, τόσο στο σπλήνα όσο και στο νεφρό. Είναι γνωστό ότι, στη σήψη ο ιστικός παράγοντας (TF), -ο κυριότερος in vivo ενεργοποιητής της εξωγενούς οδού της πήξης αλλά ταυτόχρονα, μέσω υποδοχέων PAR, ενεργοποιητής της φλεγμονής- εξωκυτταρώνεται από τα ουδετερόφιλα πάνω στις εξωκυττάριες παγίδες ουδετεροφίλων (ΝΕΤs). Προηγούμενες μελέτες μας με μικροσυστοιχίες cDNA από μυελό των οστών και miRNA από περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα αίματος ασθενών με ενεργό και ανενεργό ΣΕΛ έδειξαν ότι, οι ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ χαρακτηρίζονται από μία γονιδιακή ταυτότητα ουδετεροφίλων αλλά και από διαταραχή γονιδίων και miRNA που ρυθμίζουν την αυτοφαγία. Αναζητήθηκε στη βάση δεδομένων που δημιουργήθηκε η εμπλοκή γονιδίων αυτοφαγίας και ουδετεροφίλων στο ζωικό πρότυπο λύκου στα διάφορα στάδια του νοσήματος. Παρατηρήθηκε ότι, στο σπλήνα των ζωικών προτύπων λύκου, γονίδια αυτοφαγίας και ουδετεροφίλων είναι διαφορικά εκφραζόμενα σε σχέση με το σπλήνα υγιών προτύπων και στα τρία στάδια του νοσήματος. Επομένως, ετέθη η επιστημονική υπόθεση ότι, η επαγώμενη με αυτοφαγία μεταφορά του TF στα NETs μπορεί να αποτελεί το σύνδεσμο μεταξύ αυξημένης θρομβογένεσης και φλεγμονής που παρατηρούνται στους ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ. Επόμενος στόχος της μελέτης ήταν η διερεύνηση του ρόλου των διακοσμημένων με TF NETs στο ΣΕΛ. Απομονώθηκαν ορός και ουδετερόφιλα από υγιείς εθελοντές και ασθενείς με ενεργό ή ανενεργό ΣΕΛ. Έγιναν ex vivo καλλιέργειες ουδετεροφίλων και in vitro διεγέρσεις ή αναστολές τους. Αξιολογήθηκαν τα επίπεδα αυτοφαγίας, η ΝΕΤωση, η διακόσμηση των ΝΕΤs με τον TF και την προφλεγμονώδη IL-17 και, η προθρομβωτική δραστικότητα του TF των NETs. Ακολούθως, μελετήθηκαν νεφρικές τομές ασθενών με υπερπλαστική νεφρίτιδα λύκου ως προς την ύπαρξη NETs διακοσμημένων με TF και IL-17. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση των ΝΕΤs από ασθενείς με ΣΕΛ στη μορφολογία ανθρώπινων ποδοκυττάρων. Τα αποτελέσματα της μελέτης ήταν τα εξής: τα ουδετερόφιλα των ασθενών με ΣΕΛ εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα αυτοφαγίας σε σχέση με τα υγιή και, αυξημένη NETωση η οποία επάγεται από την αυτοφαγία. Βρέθηκε ότι, η αυτοφαγία επάγει τη μεταφορά TF στα NETs του ΣΕΛ, ο οποίος είναι προθρομβωτικός αφού παράγει θρομβίνη. Επίσης, τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι, ο ορός των ασθενών με ενεργό ΣΕΛ επάγει την αυτοφαγία και την εξαρτώμενη από αυτοφαγία ΝΕΤωση στα υγιή ουδετερόφιλα. Ταυτόχρονα, αυξάνει τα επίπεδα του TF στα υγιή ουδετερόφιλα και οδηγεί σε απελευθέρωση NETs διακοσμημένων με TF και IL-17. Όλα τα φαινόμενα που βρέθηκαν, αναστέλλονται από την υδροξυχλωροκίνη, που αποτελεί αναστολέα της αυτοφαγίας. Επίσης, η μελέτη αυτή έδειξε ότι, τα διακοσμημένα με TF και IL-17 NETs εναποτίθενται στο νεφρό ασθενών με υπερπλαστική νεφρίτιδα λύκου. Τέλος, η επώαση ανθρώπινων ποδοκυττάρων με δομές NETs από ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ τροποποίησε τη μορφολογία των ποδοκυττάρων.Συμπερασματικά, με συγκριτική μελέτη μεταγραφώματος ζωικού προτύπου λύκου χρησιμοποιώντας τεχνικές αλληλούχησης RNA νέας γενεάς, δημιουργήθηκε μία βάση δεδομένων μεταγραφώματος που χαρακτηρίζει τη γενετική ευπάθεια του ΣΕΛ, την οργανοειδικότητά του στο χρόνο και την αναπτυξιακή του βιολογία. Τα ευρήματα αποτελούν υποψήφιους βιοδείκτες εξέλιξης του νοσήματος και προσβολής των οργάνων και, υποψήφιους θεραπευτικούς στόχους στο ΣΕΛ. Η συνέχεια της μελέτης στον άνθρωπο έδειξε ότι, τα NETs αποτελούν ικρυώματα συσσώρευσης βιοδραστικών παραγόντων, μεταξύ των οποίων ο TF και η IL-17, που παραμένουν στον ιστό ακόμα και απουσία ακέραιων ουδετεροφίλων. Η ενδοθηλίνη-1 και το C5a στον ορό των ασθενών με ΣΕΛ αποτελούν τους φλεγμονώδεις μεσολαβητές που ενεργοποιούν την οδό HIF-1/REDD1, η οποία αυξάνει την αυτοφαγία στα ουδετερόφιλα και την επαγώμενη από αυτή ΝΕΤωση. Τα διακοσμημένα με TF και IL-17 NETs αποτελούν το σύνδεσμο μεταξύ αυξημένης θρομβογένεσης και φλεγμονής που παρατηρούνται στους ασθενείς με σοβαρό ΣΕΛ και, εξηγούν μέρος της ευεργετικής δράσης που έχει η υδροξυχλωροκίνη στη νεφρίτιδα λύκου. Τέλος, διαπιστώθηκε ότι τα διακοσμημένα με TF και IL-17 NETs τροποποιούν το φαινότυπο ανθρώπινων ποδοκυττάρων και αυξάνουν την παραγωγή κολλαγόνου από τους ινοβλάστες. Περιγράφηκαν οι ανοδικοί ρυθμιστές και τα καθοδικά μόρια της ΝΕΤωσης στο ΣΕΛ και προτείνεται ένα μοντέλο πολλαπλών χτυπημάτων που χρήζει θεραπείας πολλαπλών στόχων, η οποία μπορεί να επιτευχθεί με επανατοποθέτηση φαρμάκων.