Ιοειδές του λανθάνοντος μωσαϊκού της ροδακινιάς (Peach latent mosaic viroid, PLMVd) και ιοειδή των μηλοειδών στην Ελλάδα

Abstract

In Greece our information about PLMVd, ASSVd and PBCVd in cultivated and wild pome and stone fruits is limited. Our research started with a preliminary survey for the presence of the above three viroids and continued with the analytical study of PLMVd. ASSVd was detected in pears wild pears apples and wild apples in the last two species for first time in Greece and internationally respectively. High frequency of PBCVd was rescored in cultivated and w pear with blister canker symptomatology. The viroid also was detected in quince and Crataegus. The examination of peach samples revealed high (75%) incidence of PLMVd and to this peach germplasm seemed to play an important role. Also its presence in apricot plum and sweet cherry was recorded for first time in Greece and in quince for the first time internationally. Using real time RT-PCR it was estimated that the detectable viroid concentration in non-peach samples was on the average 99.6% lower than in peach. Sixty six different PLMVd clones were obtained sizing 337 to 340 nt. Sixty two of these clones were identified as new PLMVd variants. Almost all PLMVd variants of non-peach samples were grouped in a separate cluster whereas all Greek variants obtained classified together in group III according to Ambros classification. Secondary structure analysis showed that the conformation of the PLMVd variants was brunched and close to that of the type variant M835451. Later, we applied RT-LAMP. After the design and evaluation of several sets of primers and the protocol improvement the detection of PLMVd both in the lab and in the field within 30 min only was possible. Finally SYBR Green based liquid phase in situ RT-PCR established for PLMVd detection. PLMVd was detected in the chloroplasts of infected peach leaves where it is known that the viroid multiplies and concentrates.

Στην Ελλάδα, οι πληροφορίες σχετικά με τα ιοειδή PLMVd, ASSVd και PBCVd στα καλλιεργούμενα και αυτοφυή πυρηνόκαρπα, μηλοειδή είναι περιορισμένες. Η έρευνά μας ξεκίνησε με την προκαταρκτική επισκόπηση της παρουσίας στη χώρα μας των τριών παραπάνω ιοειδών και συνεχίστηκε με την αναλυτική μελέτη του PLMVd. Το ASSVd ανιχνεύθηκε σε απιδιές, άγριες απιδιές, μηλιές και άγριες μηλιές, στα δύο τελευταία είδη για πρώτη φορά στην Ελλάδα και διεθνώς, αντίστοιχα. Υψηλή συχνότητα παρουσίας του PBCVd καταγράφηκε στην καλλιεργούμενη και άγρια απιδιά με συμπτώματα εξανθημάτων έλκων. Το ιοειδές ανιχνεύθηκε επίσης στην κυδωνιά και το κράταιγιο. Υψηλή ήταν η συχνότητα παρουσίας (75%) του PLMVd στην Ελλάδα και σ’ αυτό σημαντικό ρόλο φάνηκε και παίζει το πολλαπλασιαστικό υλικό. Το PLMVd ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα στην βερικοκιά, δαμασκηνιά και κερασιά και, για πρώτη φορά διεθνώς στην κυδωνιά. Η συγκέντρωση του ιοειδούς στα παραπάνω είδη υπολογίστηκε, με τη βοήθεια της real time RT-PCR ήταν κατά μέσο όρο 99.6% μικρότερη από εκείνη στη ροδακινιά. Αποκτήθηκαν συνολικά 66 κλώνοι PLMVd μεγέθους 337-340 nt από τους οποίους 62 αποτέλεσαν νέες παραλλαγές. Οι παραλλαγές που δεν προήλθαν από ροδακινιές συναθρίστηκαν σε ξεχωριστή ομάδα, ενώ όλες μαζί οι ελληνικές παραλλαγές συναθροίστηκαν στην ομάδα ΙΙΙ κατά Ambros. Ανάλυση δευτεροταγούς δομής έδειξε διακλαδωτή διαμόρφωση των παραλλαγών πλησιάζοντας εκείνη της πρότυπης παραλλαγής Μ835451. Στη συνέχεια, εφαρμόστηκε η RT-LAMP. Σχεδιάζοντας και αξιολογώντας διάφορες ομάδες εκκινητών και βελτιστοποιώντας το πρωτόκολλο, ήταν δυνατή η ανίχνευση του PLMVd μόλις 30 λεπτά, τόσο στο εργαστήριο όσο και στον αγρό. Τέλος, εφαρμόστηκε η βασιζόμενη στη χρήση SYBR Green, υγρής φάσης in situ RT-PCR με τη βοήθεια της οποίας το PLMVd εντοπίστηκε στους χλωροπλάστες φύλλων ροδακινιάς όπου άλλωστε είναι γνωστό ότι αυτό πολλαπλασιάζεται και συσσωρεύεται.