Ταυτοποίηση, ποσοτικός προσδιορισμός και εποχικές μεταβολές φαινολικών ενώσεων μεταξύ και εντός ποικιλιών ελιάς και μοριακή ταυτοποίηση: ιχνηλασία των προϊόντων ελιάς

Abstract

Since the dawn of Hellenic history, olive tree and its products are present as avital and essential socioeconomical element. The constant demand by the consumersnot only for improving the quality of olive tree products but also for ascertaining theirorigin, particularly if these products have been defined as products of specificgeographical origin (i.e. Kalamon Olives), has led to the necessity for identification ofthe different olive tree cultivars and traceability of their products. At the same time,olive products (olive oil and table olives) play a fundamental part to theMediterranean diet, a diet with high content of bioactive substances such as vitamins,flavonoids and polyphenols. It is well known that phenolic compounds areconstituents of many plants and they have attracted a great deal of public andscientific interest because of their health promoting effects as antioxidants.The purpose of the first part of this study was the identification of ten olivevarieties (“Koroneiki”, “Lianolia Kerkyras”, “Mastoidis”, “Arbequina”,“Adramytini”, “Megaritiki”, “Gaidourelia”, “Kalamon”, “Konservolia’ and“Chalkidiki’) and the study of intra - varietal variability of the four most commonvarieties in Greece (“Koroneiki”, “Kalamata”, “Konservolia” and “L. Kerkyras”)using SSR primers. Furthermore, molecular markers originating from two differentmolecular techniques, RAPD and SSR, were used for the identification andtraceability of the products of the ten varieties of olive using new season leaves, greenand black drupes. According to the results, SSR molecular markers, effectivelyseparated the varieties grouping according to the size of the fruit and their use. In theintra-varietal level, SSR markers, grouped the trees of each variety giving identicalallelic profiles. Identification of green and black drupes using RAPD and SSR primerswas performed for the first time for Greek varieties. The RAPD primers gave productswith similar patterns while the SSR primers gave identical allelic patterns betweenleaves and drupes of the same variety. Both methods can be used for identificationand traceability of the olive drupes, with SSR primers, being more reliable.In the second part of this study, the same ten olive varieties, were studied fortotal phenolic concentration, as well as for the antioxidant capacity of leaves and fruits ofdifferent seasons and years.Total phenolic concentration was expressed as milligrams of gallic acidequivalents (GAE) per gram of fresh tissue and the antioxidant activity was expressed through index IC50 (Inhibition Concentration, mg/l of extract) which indicates the extractconcentration required to reduce the initial DPPH concentration by 50%. Separation andidentification of phenolic compounds was carried out with an analytical HPLC system.According to the results, total phenolic concentration varied among varietiesand among different tissues.Different varieties showed different total phenolic concentration but similarphenolic profile. For both years, 2008 - 2009, most varieties had a higher totalphenolic concentration in young leaves than in green and black drupes. In the newleaves of April 2008, total phenolic concentration varied between 10,1 - 20,6 mg GAE/ g F.W. while in the green and black drupes ranged between 5,9 - 19,8 mg GAE / gF.W. and 5,4 - 9,9 mg GAE / g F.W. respectively. In the new leaves of April 2009,total phenolic concentration varied between 12,5 - 18,7 mg GAE / g F.W. and in thegreen and black drupes ranged between 4,1 - 13,9 mg GAE / g F.W. and 5,6 - 10,1 mgGAE / g F.W. respectively.New leaves of April 2009 had a higher total phenolic concentration (12,5 -18,7 mg GAE / g F.W.) than of September (10.6 and 15,3 mg GAE / g F.W.) andDecember (10.3 and 17,0 mg GAE / g F.W.). Comparing the two years (2008 – 2009),for most varieties, new leaves of April 2009 had a higher total phenolic concentrationthan the new leaves in April 2008 while green drupes, for most varieties, had a highertotal phenolic concentration in 2008 than in 2009. A positive correlation was foundbetween the concentration of total phenolics and antioxidant capacity.The phenolic profile was similar between varieties but the concentrations ofeach phenolic compound was different.The main phenolic compounds in the phenolic profile of leaves wereoleuropein, rutin, 7-O-glycoside of louteolin, 4-O-glycoside of louteolin and 7-Oglycosideof apigenin, while in green and black drupes the main phenolic substanceswere oleuropein, rutin, 7-O-glycoside of louteolin and verbascoside.

Για πολλούς αιώνες η ιστορία της ελιάς και των προϊόντων της είναι άρρηκταδεμένη με την ιστορία της Ελλάδας. Τα προϊόντα της ελιάς, επιτραπέζιες ελιές καιελαιόλαδο, παίζουν σημαντικό κοινωνικοοικονομικό ρόλο στη χώρα μας. Η συνεχήςαπαίτηση του αγοραστικού κοινού τόσο για βελτίωση και διασφάλιση της ποιότηταςτων παραγόμενων προϊόντων της ελιάς όσο και για πιστοποίηση της προέλευσήςτους, ειδικά όταν πρόκειται για προϊόντα ονομασίας προέλευσης (π.χ ελιέςΚαλαμών), έχει οδηγήσει στην ανάγκη ταυτοποίησης των διαφόρων ποικιλιών καιιχνηλασίας των προϊόντων τους. Επίσης, τα προϊόντα της ελιάς, αποτελούναναπόσπαστο κομμάτι της Μεσογειακής δίαιτας, μιας δίαιτας με υψηλήπεριεκτικότητα σε βιοενεργές ουσίες όπως βιταμίνες, φλαβονοειδή και πολυφαινόλες.Είναι γνωστό ότι οι φαινολικές ενώσεις αποτελούν συστατικά πολλών φυτών καιέχουν προσελκύσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας καθώς προάγουντην υγεία των καταναλωτών κυρίως λόγω της αντιοξειδωτικής τους ικανότητας.Σκοπός του πρώτου μέρους της παρούσας εργασίας, ήταν ο διαχωρισμός δέκαποικιλιών («Κορωνέικη», «Λιανολιά Κερκύρας», «Μαστοειδής», «Arbequina»,«Αδραμυττινή», «Μεγαρείτικη», «Γαϊδουρελιά», «Καλαμών», «Κονσερβολιά»,«Χαλκιδικής») και η μελέτη της ενδο – ποικιλιακής παραλλακτικότητας τωντεσσάρων πιο διαδεδομένων στον Ελλαδικό χώρο ποικιλιών («Κορωνέικη»,«Καλαμών», «Κονσερβολιά» και «Λ. Κερκύρας») με την χρήση SSR εκκινητών.Επίσης μελετήθηκε η ταυτοποίηση και η ιχνηλασία των προϊόντων των δέκαποικιλιών ελιάς χρησιμοποιώντας νέα φύλλα, πράσινους και μαύρους καρπούς καιεφαρμόζοντας δύο διαφορετικές μοριακές μεθόδους, εκείνες των δεικτών RAPDs καιSSRs.Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η εφαρμογή της μεθόδου των μοριακώνδεικτών SSR προκειμένου να διαχωριστούν οι δέκα προς μελέτη ποικιλίες κρίθηκεαποτελεσματική. Οι ποικιλίες διαχωρίστηκαν μεταξύ τους και ομαδοποιήθηκαν σεδύο ομάδες σύμφωνα με το μέγεθος του καρπού και την χρήση τους. Επίσης, οιεκκινητές SSR, ενδο-ποικιλιακά, ομαδοποίησαν τα ελαιόδεντρα της κάθε ποικιλίαςδίνοντας πανομοιότυπα αλληλόμορφα προφίλ. Τέλος στην παρούσα μελέτηεπιτεύχθηκε, για πρώτη φορά σε Ελληνικές ποικιλίες, η ταυτοποίηση πράσινων καιμαύρων καρπών με την χρήση RAPD και SSR εκκινητών. Οι RAPD εκκινητέςέδωσαν προϊόντα με παρόμοια πρότυπα ενώ οι SSR εκκινητές έδωσαν πανομοιότυπα πρότυπα αλληλομόρφων μεταξύ φύλλων και καρπών της ίδιας ποικιλίας. Και οι δύομέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην ταυτοποίηση και ιχνηλασία των καρπώντης ελιάς, αλλά οι δείκτες SSR, που έδωσαν πανομοιότυπα πρότυπα κρίνονται πιοαξιόπιστοι.Στο δεύτερο μέρος της παρούσας μελέτης, οι ίδιες δέκα ποικιλίες ελιάςμελετήθηκαν ως προς την συγκέντρωση των συνολικών φαινολικών καθώς επίσηςκαι ως προς την αντιοξειδωτική ικανότητα φύλλων και καρπών τους διαφορετικώνεποχών και ετών. Επίσης, πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση και ποσοτικόςπροσδιορισμός των φαινολικών ουσιών. Η συγκέντρωση των ολικών φαινολικώνεκφράστηκε σε mg ισοδύναμα γαλλικού οξέος (GAE) ανά gr νωπού φυτικού ιστούκαι η αντιοξειδωτική δράση εκφράστηκε σε ppm με τη μορφή του δείκτη IC50(Inhibition Concentration) ο οποίος δηλώνει τη συγκέντρωση εκείνη του δείγματοςπου απαιτείται για να μειωθεί η αρχική συγκέντρωση του διαλύματος DPPH κατά50%. Η ταυτοποίηση και η ποσοτικοποίηση των επιμέρους φαινολικών συστατικώνπραγματοποιήθηκε με τη χρήση συστήματος υγρής χρωματογραφίας υψηλήςαπόδοσης (HPLC).Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης η συγκέντρωση τωνσυνολικών φαινολικών διέφερε τόσο μεταξύ των ποικιλιών όσο και μεταξύ των ιστώνανά ποικιλία. Οι διαφορετικές ποικιλίες παρουσίασαν διαφορετική συγκέντρωσησυνολικών φαινολικών αλλά παρόμοιο φαινολικό προφίλ. Και για τις δύο χρονιές,2008 - 2009, οι περισσότερες ποικιλίες παρουσίασαν υψηλότερη συγκέντρωσησυνολικών φαινολικών στα νέα φύλλα από ότι στους πράσινους και μαύρουςκαρπούς. Στα νέα φύλλα Απριλίου του 2008 η συγκέντρωση συνολικών φαινολικώνκυμάνθηκε μεταξύ 10,1 - 20,6 mg GAE/g ν.φ.ι. ενώ στους πράσινους και μαύρουςκαρπούς του ιδίου έτους κυμάνθηκε μεταξύ 5,9 - 19,8 mg GAE/g ν.φ.ι. και 5,4 - 9,9mg GAE/g ν.φ.ι. αντίστοιχα. Στα νέα φύλλα Απριλίου του 2009 η συγκέντρωσησυνολικών φαινολικών κυμάνθηκε μεταξύ 12,5 - 18,7 mg GAE/g ν.φ.ι. ενώ στουςπράσινους και μαύρους καρπούς κυμάνθηκε μεταξύ 4,1 - 13,9 mg GAE/g ν.φ.ι. και5,6 - 10,1 mg GAE/g ν.φ.ι. αντίστοιχα. Τα νέα φύλλα Απριλίου του 2009παρουσίασαν υψηλότερη συγκέντρωση συνολικών φαινολικών (12,5 - 18,7 mgGAE/g ν.φ.ι.) από τα φύλλα Σεπτεμβρίου (10,6 και 15,3 mg GAE/g ν.φ.ι.) –Δεκεμβρίου (10,3 και 17,0 mg GAE/g ν.φ.ι.) του ιδίου έτους. Συγκρίνοντας τις δύοχρονιές, 2008 – 2009, για τις περισσότερες ποικιλίες, τα νέα φύλλα Απριλίου του2009 παρουσίασαν υψηλότερη συγκέντρωση συνολικών φαινολικών από τα νέαφύλλα Απριλίου του 2008 ενώ οι πράσινοι καρποί, για τις περισσότερες ποικιλίες,παρουσίασαν υψηλότερη συγκέντρωση συνολικών φαινολικών το 2008 από ότι το 2009. Βρέθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης των συνολικώνφαινολικών και της αντιοξειδωτικής ικανότητας.Το φαινολικό προφίλ ήταν παρόμοιο μεταξύ των ποικιλιών διέφερε όμως ωςπρος τις συγκεντρώσεις της κάθε φαινολικής ουσίας.Oι κυριότερες φαινολικές ουσίες στα φύλλα ήταν η ελευρωπαΐνη, η ρουτίνη, ο7-Ο-γλυκοζίτης της λουτεολίνης, ο 4-Ο-γλυκοζίτης της λουτεολίνης και ο 7-Ο-γλυκοζίτης της απιγενίνης, ενώ στους πράσινους και στους μαύρους καρπούς ηελευρωπαΐνη, η ρουτίνη, ο 7-Ο-γλυκοζίτης της λουτεολίνης και ο βερμπασκοζίτης.