Μελέτη βιοϋλικών με απεικονιστική μικροσκοπία ατομικής δύναμης

Abstract

The main aim of this Phd thesis was the investigation of collagen fibrils in nanoscale under the influence of ultraviolet and low level red laser irradiation. The research was conducted by using innovative Atomic Force Microscopy techniques in order to eliminate errors during the experimental procedures.The research objectives of the current Phd thesis were:a) The development of AFM imaging and mechanical testing techniques for the characterization of collagen nanoscale features.b) The development of techniques for the re-isolation of the same collagen fibril in nanoscale prior and post the influence of a controlled external factor.c) The application of the nanoindentation technique in nanoscale areas.d) The development of Young’s modulus maps for the mechanical characterization of extended nanoscale areas.e) The development of innovative techniques for the mechanical testing of heterogeneous materials in nanoscale and the investigation of the influence of controlled external factors in specific nanoscale features based on the percentage differences of the Young’s modulus values. The percentage differences of the Young’s modulus are independent of quantities which provide significant errors (cantilever’s spring constant and tip’s shape and size).f) The investigation of the mechanical heterogeneity on collagen thin films in nanoscale.g) The investigation of the influence of UV irradiation on collagen fibrils in nanoscale focusing on the D – Band periodicity (topography and mechanical properties). h) The investigation of the influence of Red Low Power laser irradiation on collagen fibrils in nanoscale (topography and mechanical properties).The irradiation wavelengths that were chosen are crucial for many medical and biological activities. In particular, a critical issue regarding the collagen research is the influence of UV rays on structural and mechanical properties of collagen fibrils. UV irradiation is one of the most harmful external factors, which affect collagen basic properties and leads to photo – degradation. Photo – degradation of collagen is responsible for skin wrinkles and probably results in skin cancer. As a result, UV irradiation is responsible for the acceleration of collagen damage in normal aging. Moreover, many skin changes like easy bruising which were believed to be a result of aging, are in fact related to prolonged UV exposure. In addition, the UV – collagen interaction affects the cell response, since it has been reported that cells that were cultured on UV-irradiated collagen-based materials are influenced by UV irradiation parameters. Hence, due to the chronic exposure of human skin to sun light the clarification of the UV - collagen interaction mechanisms is crucial. Although the UV-collagen interaction mechanisms have been previously studied, the influence of UV irradiation on D-band periodicity has not yet been investigated. Hence, the investigation of the influence of UV rays on collagen’s basic nanoscale characteristics, like the D – periodicity, is of great importance in the fields of medicine, biology and tissue engineering. Respectively, it has been reported that red light irradiation appears to have a wide range of effects on tissues from nanoscale to macroscale. Specifically, it has been proved that red light not only presents anti-inflammatory and analgesic effects on human skin, but also helps the regenerative capacity of the tissues. Moreover, it has been reported that the red laser treatment contributes to tendon healing. In addition, it has been suggested that red and infrared light from the sun, which predominate in the morning, probably provide a protection against UV irradiation because they prepare (due to natural mechanisms) the human skin for the UV wavelengths which dominate at noon. Hence, the investigation of the effects of red light on collagen in nanoscale due to the fact that most parts of the human body (e.g. skin, bone, cartilage, or tendons) contain collagen, and especially collagen type I, in the form of collagen fibrils is crucial as far as red light therapy is concerned.The mechanical heterogeneity of collagen was investigated using the AFM phase imaging and nanoindentation methods. The kink areas (areas in which collagen fibrilschange abruptly direction and are a result of strong mechanical deformation) presented different phase contrast comparing to the other parts of the fibrils. In addition the Young’s modulus values of the kink areas were resulted significantly different from the values of the other fibrils’ parts. Hence, the nanoindentation method confirmed the alteration of collagen fibrils mechanical properties in kinks areas. Furthermore, the results showed that overlapping and gap regions had a significant phase contrast which can be related to different mechanical properties. In addition, quantitative measurements have validated the hypothesis that overlapping regions have different Young’s modulus values than the gap regions.The impact of UV irradiation on collagen was investigated in nanoscale using Atomic Force Microscopy (AFM). High resolution images of individual collagen fibrils and load - displacement curves on the overlapping and gap regions, under various time intervals of UV exposure, were obtained. The results demonstrated that the UV rays affect the height level differences between the overlapping and gap regions. Under various time intervals of UV exposure, the height difference between overlaps and gaps reduced from ~3.7 nm to ~0.8 nm and the fibril diameters showed an average of 8-10% reduction. In addition, the irradiation influenced the mechanical properties of collagen fibrils. The Young’s modulus values were reduced per 66% (overlaps) and 61% (gaps) compared to their initial values. The observed alterations on the structural and the mechanical properties of collagen fibrils are probably a consequence of the polypeptide chain scission due to the impact of the UV irradiation. In addition, the effects of red light on collagen in the nanoscale were also recorded using Atomic Force Microscopy. The research was conducted in two stages. Firstly, collagen fibrils that were not fully formed (i.e. the D – Band periodicity did not occur in all the regions across the fibrils) were used as a model of damaged fibrils and irradiated for 20 short time periods (each irradiation had a duration of 45 seconds and a rest period of 60 seconds).The results indicated that red light led to the full creation of the D – Band periodicity. Moreover, a 25.2% reduction of the average width of the fibrils was recorded. In addition, in the first category of the second stage of experiments collagen fibrils with natural occurring characteristics were irradiated by using the same protocol (short time periods with duration of 45 seconds and a rest period of 60 seconds). The results indicated that the red light did not affect the structural characteristics of the fibrils but changed its mechanical properties.The second category of the second stage of experiments was performed using continuous irradiation procedure for 15 and 60 minutes respectively. In the case of the 15 minutes of irradiation the results were almost the same with the first protocol after the 20 doses of irradiation. In the case of the 60 minutes of irradiation, the results indicated that red laser altered the dimensions of the fibrils (the reduction of the average width of the fibrils was 14% while the increase in the average height of the fibrils was 5%). Moreover, the red laser altered the mechanical properties of the fibrils (the increase of the average Young’s modulus value within the same area on the fibril, post irradiation, was 24.5%). The observed alterations of structural and mechanical properties of collagen fibrils under the influence of low level red laser will provide new insights on medical applications. In addition, it must be noted that for both the irradiation procedures (using UV and red light irradiation) the experiments were carried out on the same collagen fibril each time (prior and post the irradiation) in order to extract results, independently of possible differences between collagen fibrils.Lastly, a more accurate and simple approach of the nanoindentation procedure based on the percentage differences of Young’s modulus values was introduced. The new approach can be applied in experiments where the influence of a controlled external factor in a specific nanoregion is tested or in experiments in which variations in the mechanical properties of heterogeneous materials are investigated. The analysis was based on the general mathematical analysis which is used in the indentation procedure for the characterization of biological samples. The major advantage of the new technique is its dependence only on the cantilever’s deflection – displacement curves which can be obtained with great accuracy. In addition, in order to provide full insight into the new technique, the mechanical heterogeneity of collagen was examined. As a conclusion, when a sample is tested under the influence of a controlled external factor, or when inhomogeneous samples are tested, the determination of the percentage variations of the Young’s modulus is the most accurate approach.

Αντικείμενο της Διδακτορικής Διατριβής αποτελεί η μελέτη ινών κολλαγόνου υπό την επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας και ακτινοβολίας laser στην περιοχή του ερυθρού. Η έρευνα πραγματοποιήθηκε μέσω της ανάπτυξης τεχνικών Απεικονιστικής Μικροσκοπίας Ατομικής Δύναμης και καινοτόμων τεχνικών για την ασφαλέστερη εξαγωγή αποτελεσμάτων τόσο κατά τη διαδικασία απεικόνισης των δειγμάτων όσο και κατά τη μελέτη των μηχανικών ιδιοτήτων.Επιμέρους αντικείμενα της έρευνας αποτέλεσαν: α) η ανάπτυξη τεχνικών χαρακτηρισμού και απεικόνισης λεπτών υμενίων κολλαγόνου σε νανοκλίμακα με Απεικονιστική Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης, β) η ανάπτυξη τεχνικών επαναπροσδιορισμού της ίδιας νανοπεριοχής ενός δείγματος πριν και μετά την επίδραση ενός ελεγχόμενου εξωτερικού παράγοντα,γ) η εφαρμογή τεχνικών υπολογισμού του μέτρου ελαστικότητας σε νανοπεριοχές του εξεταζόμενου δείγματος,δ) η κατασκευή χαρτών μέτρου ελαστικότητας για την μελέτη εκτεταμένων περιοχών σε νανοκλίμακα ως προς τις μηχανικές ιδιότητες,ε) η ανάπτυξη τεχνικών μελέτης των ποσοστιαίων μεταβολών του μέτρου ελαστικότητας υπό την επίδραση ελεγχόμενων εξωτερικών παραγόντων χωρίς τα σφάλματα που προέρχονται από τη σταθερά ελατηρίου του χρησιμοποιούμενου προβολού και το ακριβές σχήμα και μέγεθος της ακίδας, στ) η μελέτη της μηχανικής ανομοιογένειας των λεπτών υμενίων κολλαγόνου σε νανοκλίμακα,ζ) η μελέτη της επίδρασης της υπεριώδους ακτινοβολίας σε μεμονωμένες ίνες κολλαγόνου με εστίαση στη χαρακτηριστική D – περιοδικότητα (τόσο ως προς τις δομικές όσο και ως προς τις μηχανικές τους ιδιότητες),η) η μελέτη της επίδρασης της ακτινοβολίας laser χαμηλής ισχύος στην περιοχή του ερυθρού σε μεμονωμένες ίνες κολλαγόνου (τόσο ως προς τις δομικές όσο και ως προς τις μηχανικές τους ιδιότητες).Όσον αφορά την επίδραση της ακτινοβολίας επιλέχθηκαν οι συγκεκριμένες περιοχές του Η/Μ φάσματος διότι παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για μια πληθώρα από ιατρικές και βιοϊατρικές εφαρμογές. Συγκεκριμένα, αντικείμενο της έρευνας αποτέλεσε η ακτινοβόληση στην υπεριώδη περιοχή (UV-C, 254 nm) και στην ερυθρή περιοχή (με laser χαμηλής ισχύος, 661 nm). Η υπεριώδης ακτινοβολία παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς χρησιμοποιείται για αποστείρωση και επεξεργασία βιοϋλικών με βάση το κολλαγόνο ενώ παράλληλα αποτελεί έναν από τους κύριους παράγοντες φωτο-γήρανσης του δέρματος και πρόκλησης δερματικού καρκίνου. Η χαμηλής ισχύος ακτινοβολία στην περιοχή του ερυθρού εφαρμόζεται για την ονομαζόμενη Low-Level Laser Therapy, η οποία έχει ένα ευρύ φάσμα από εφαρμογές, μεταξύ των οποίων η επούλωση πληγών. Για τη μελέτη της μηχανικής ανομοιογένειας των λεπτών υμενίων κολλαγόνου μελετήθηκαν οι μηχανικές ιδιότητες (ποσοτικός προσδιορισμός μέτρου ελαστικότητας) σε σημεία των ινών με απότομη αλλαγή κατεύθυνσης και συγκρίθηκαν με τις τιμές των του μέτρου ελαστικότητας στα υπόλοιπα σημεία των ινών. Η ποιοτική μελέτη της μηχανικής ανομοιογένειας των λεπτών υμενίων πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο απεικόνισης φάσης. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν σημαντική διαφοροποίηση του μέτρου ελαστικότητας στις συγκεκριμένες περιοχές και οδηγούν στην επικύρωση του μοντέλου της σωληνοειδούς δομής της ίνας του κολλαγόνου. Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε η μηχανική ανομοιογένεια των ινών λόγω της D – περιοδικότητας. Η μέθοδος απεικόνισης φάσης επικύρωσε τα παραπάνω αποτελέσματα.Για τη μελέτη της επίδρασης της UV ακτινοβολίας στα νανοχαρακτηριστικά του κολλαγόνου, λεπτά υμένια κολλαγόνου ακτινοβολήθηκαν, με ελεγχόμενες δόσεις υπεριώδους ακτινοβολίας. Με τη βοήθεια της μικροσκοπίας ατομικής δύναμης κατεγράφησαν οι δομικές αλλαγές στις διαστάσεις και τη χαρακτηριστική περιοδικότητα των ινών, ενώ παράλληλα μελετήθηκε και η ποσοστιαία μεταβολή του μέτρου ελαστικότητας λόγω της ακτινοβόλησης. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η υπεριώδης ακτινοβολία προκαλεί σημαντικές δομικές αλλοιώσεις στις ίνες κολλαγόνου (μείωση της υψομετρικής διαφοράς ‘ορέων’ και κοιλάδων’ και των διαμέτρων των ινών). Επίσης επηρεάζει σημαντικά τις μηχανικές ιδιότητες των ινών κολλαγόνου. Συγκεκριμένα, το ποσοστό μείωσης του μέτρου ελαστικότητας στις περιοχές ‘ορέων’ προσδιορίστηκε 68%, ενώ των ‘κοιλάδων’ 61%. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι μεγάλοι χρόνοι έκθεσης στην υπεριώδη ακτινοβολία οδηγούν στην αλλοίωση της μηχανικής ανομοιογένειας των ινών κολλαγόνου.Η μελέτη της επίδρασης της ακτινοβολίας laser στην περιοχή του ερυθρού στα νανοχαρακτηριστικά του κολλαγόνου πραγματοποιήθηκε σε δύο στάδια. Στο πρώτο στάδιο χρησιμοποιήθηκε διάλυμα κολλαγόνου μικρής διάρκειας ζωής για την παρασκευή των λεπτών υμενίων με αποτέλεσμα οι ίνες που σχηματίστηκαν να παρουσιάζουν ατέλειες στη χαρακτηριστική D – περιοδικότητα. Η παραπάνω διαδικασία αποτελεί προσομοίωση κολλαγόνου με ατέλειες λόγω γήρατος ή ασθενειών. Η ακτινοβόληση στην περίπτωση αυτή πραγματοποιήθηκε σε 20 δόσεις των 45 δευτερολέπτων με ένα λεπτό ηρεμίας μεταξύ δύο διαδοχικών δόσεων. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ερυθρή ακτινοβολία laser χαμηλής ισχύος οδηγεί στον πλήρη σχηματισμό της D – περιοδικότητας, αλλά και στη μείωση κατά ~25% του πάχους των ινών. Στο δεύτερο στάδιο ίνες κολλαγόνου με πλήρως σχηματισμένη δομή ακτινοβολήθηκαν αρχικά με διακοπτόμενες δόσεις ακτινοβόλησης και στη συνέχεια με συνεχή ακτινοβόληση για μεγάλα χρονικά διαστήματα (15 λεπτά και 60 λεπτά). Στην περίπτωση της διακοπτόμενης ακτινοβόλησης δεν κατεγράφησαν δομικές διαφοροποιήσεις στα επιφανειακά χαρακτηριστικά του υμενίου, παρουσιάστηκε όμως αλλοίωση της μηχανικής ετερογένειας των ινών. Επίσης τα αποτελέσματα μετά τη συνεχή ακτινοβόληση των 15 λεπτών ήταν ταυτόσημα με τα αποτελέσματα των 20 δόσεων με το πρωτόκολλο της διακοπτόμενης ακτινοβόλησης. Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι το πρωτόκολλο ακτινοβόλησης δεν επηρεάζει το κολλαγόνο, με προϋπόθεση η συνολική πυκνότητα ενέργειας να είναι η ίδια. Στην περίπτωση της συνεχούς ακτινοβόλησης των 60 λεπτών, τα αποτελέσματα υποδεικνύουν σημαντικές αλλαγές στις διαστάσεις των ινών (~14% μείωση του πάχους και ~5% αύξηση του ύψους). Στην περίπτωση αυτή δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφοροποιήσεις στη χαρακτηριστική D – περιοδικότητα. Οι χάρτες μέτρου ελαστικότητας κατασκευάστηκαν για μία επιλεγμένη περιοχή ίνας κολλαγόνου πριν και μετά την ακτινοβόληση. Η επίδραση της ακτινοβολίας στις μηχανικές ιδιότητες του κολλαγόνου υπήρξε καταλυτική καθώς κατεγράφη αύξηση κατά 24.5% της μέσης τιμής του μέτρου ελαστικότητας της επιλεγμένης περιοχής μετά την ακτινοβόληση. Τέλος αξίζει να σημειωθεί ότι σε κάθε διαδικασία ακτινοβόλησης (τόσο με UV όσο και με ερυθρή ακτινοβολία) η μελέτη πραγματοποιήθηκε στην ίδια ίνα, σε κάθε περίπτωση, για την απόκτηση πραγματικά αξιόπιστων αποτελεσμάτων χωρίς ενδεχόμενα σφάλματα λόγω διαφορών που παρουσιάζονται μεταξύ των ινών του υμενίου (π.χ. σε κάθε υμένιο κολλαγόνου παρουσιάζονται ίνες διαφορετικών πάχους που κυμαίνονται στο εύρος 300nm – 700nm).Τέλος, αναδείχθηκε η σημασία της ποσοστιαίας μεταβολής του μέτρου ελαστικότητας (στην γενικότερη περίπτωση, υπό την επίδραση οποιουδήποτε ελεγχόμενου εξωτερικού παράγοντα) καθώς ο υπολογισμός της ποσοστιαίας μεταβολής του μέτρου ελαστικότητας είναι ανεξάρτητος από τυπικά σφάλματα του μικροσκοπίου ατομικής δύναμης που οφείλονται κυρίως στην άγνοια της ακριβούς τιμής της σταθεράς του προβόλου (η τιμή της οποίας εισάγει σφάλματα έως και 20% στην τιμή του μέτρου ελαστικότητας) αλλά και στην άγνοια του ακριβούς σχήματος και μεγέθους της ακίδας (η τιμή της οποία επίσης επίσης εισάγει σφάλματα ~20%). Αξίζει να σημειωθεί ότι η νέα μέθοδος χαρακτηρισμού μηχανικών ιδιοτήτων μπορεί να εφαρμοστεί σε κάθε βιοϋλικό ακόμα και σε περιπτώσεις μελέτης μηχανικών ανομοιογενειών στο ίδιο δείγμα.