Κυτταροπλασματική ασυμβατότητα: συγκριτική μελέτη στελεχών Wolbachia στη Drosophila

Abstract

The α-proteobacterium Wolbachia pipientis is a very common cytoplasmic symbiont of insects, crustaceans, mites and filarial nematodes. To enhance its transmission, Wolbachia has evolved a large scale of host manipulations: parthenogenesis induction, feminization and male killing. Wolbachia’ s most common effect is a crossing incompatibility between infected males and uninfected females termed Cytoplasmic Incompatibility (CI). Little is known about the genetics and biochemistry of these symbionts because of their fastidious requirements. Such inherited microorganisms are thought to have been major factors for the evolution of sex determination and speciation. Wolbachia isolates are also of interest as vectors for the modification of wild insect populations and biological pest control. The means by which Wolbachia induces CI are currently unknown. However, there is a general consensus that Wolbachia somehow modifies sperm during spermatogenesis and this modification has to be rescued by the same bacterial strain in the egg, for normal development to proceed. In any other case, paternal chromosomes behave abnormally after fertilization and the embryo dies due to asynchronous mitoses. This thesis approached the mechanism of CI by different aspects. Firstly, in preparation for complete genome sequencing project, I estimated the genome sizes of two Wolbachia strains using pulse-field gel electrophoresis and developed a method to purify Wolbachia chromosomal DNA. Secondly, I demonstrated that Wolbachia infections could be simply established, maintained and stored in vitro using standard tissue culture techniques. Finally and most importantly, I monitored the bacterium during germ line development of the fly, where Wolbachia exerts its action. Particularly, I described the growth and distribution of Wolbachia during spermatogenesis, oogenesis and embryogenesis in several different host/symbiont genetic combinations in Drosophila species. Considerable intra- and inter-strain variation in Wolbachia density and tissue distribution was observed. To dissect the relative contribution of host and symbiont factors to the expression of CI I compared the properties of a single Wolbachia strain in different host genetic backgrounds and different Wolbachia strains in the same host background. These experiments demonstrated that the ability to express CI is an intrinsic Wolbachia trait and is not determined by host factors. The level of sperm modification in those lines harboring bacteria capable of modifying sperm however is influenced by host genetic background. Finally, numbers of infected sperm cysts are positively correlated with CI levels. From an evolutionary point of view, it seems that host-symbiont co-evolution is leading to low CI levels, high maternal transmission and low fitness cost of the infection. These three factors are probably linked through a unique feature: bacterial density. Ultimately, a complete understanding of CI will include unraveling the deeper relationships between developmental dynamics of infection and the interplay of host genetic backgrounds with Wolbachia.

Η Wolbachia ανήκει στην α-υποομάδα των πρωτεοβακτηρίων. Είναι ένα υποχρεωτικά ενδοκυττάριο, μητρικά κληρονομούμενο βακτήριο, το οποίο μολύνει αρθρόποδα και νηματώδεις. Προκαλεί μία σειρά αναπαραγωγικών ανωμαλιών στους ξενιστές της, όπως παρθενογένεση, θηλυκοποίηση, θανάτωση αρσενικών εμβρύων και κυτταροπλασματική ασυμβατότητα, οι οποίες ευνοούν τη μετάδοση και εξάπλωσή της. Η Wolbachia την τελευταία δεκαετία έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον των ερευνητών, λόγω του ρόλου της σε βασικές εξελικτικές διαδικασίες, όπως η συμβίωση και η ειδογένεση. Επιπρόσθετα, η Wolbachia θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο για το γενετικό μετασχηματισμό εντόμων, τα οποία προκαλούν βλάβες στον τομέα της γεωργίας και της υγείας. Η καλύτερα μελετημένη εμπλοκή της Wolbachia στην αναπαραγωγή των εντόμων, είναι η κυτταροπλασματική ασυμβατότητα. Στην πιο απλή της μορφή έχει ως αποτέλεσμα τη θνησιμότητα των εμβρύων, που προέρχονται από τη διασταύρωση ενός μολυσμένου αρσενικού με ένα μη μολυσμένο θηλυκό. Αρκετοί παράγοντες, γενετικοί και περιβαλλοντικοί, έχουν αναγνωριστεί μέχρι σήμερα, οι οποίοι επηρεάζουν τα επίπεδα της ασυμβατότητας (τον αριθμό των αυγών που δεν εκκολάπτονται). Παρόλα αυτά ο μοριακός μηχανισμός της παραμένει άγνωστος. Η Wolbachia κατά γενική παραδοχή τροποποιεί τα πατρικά χρωμοσώματα κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης. Αυτή η τροποποίηση μπορεί να εξουδετερωθεί μόνο αν το ίδιο βακτηριακό στέλεχος είναι παρών στο έμβρυο. Σε διαφορετική περίπτωση διακόπτεται η ανάπτυξη του εμβρύου λόγω της μη κανονικής συμπεριφοράς των πατρικών χρωμοσωμάτων στις πρώτες μιτωτικές διαιρέσεις, που ακολουθούν τη γονιμοποίηση. Μοριακές και βιοχημικές μικροβιολογικές μελέτες, οι οποίες θα βοηθούσαν στην κατανόηση της δράσης του βακτηρίου, είναι δύσκολες λόγω της αδυναμίας του να καλλιεργηθεί σε θρεπτικά μέσα, χωρίς κύτταρα. Για αυτόν το λόγο, η παρούσα διατριβή εστιάστηκε από τη μία στην ανάπτυξη εργαλείων για τον ευκολότερο χειρισμό του βακτηρίου και από την άλλη στη μελέτη της συμπεριφοράς του κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης της γαμετικής σειράς της μύγας. Όσον αφορά στον πρώτο τομέα αναπτύχθηκε μία μέθοδος απομόνωσης γενωμικού DNA από Wolbachia, απαλλαγμένου σε ικανοποιητικό ποσοστό από DNA ξενιστή, καθώς και μία μέθοδος in vitro μόλυνσης κυτταρικών σειρών, με το εν λόγω βακτήριο. Η δεύτερη διάσταση της διατριβής αυτής αφορά στη συγκριτική κυτταρολογική μελέτη μιας πληθώρας στελεχών, που εκφράζουν διαφορετικά επίπεδα ασυμβατότητας. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε ο πολλαπλασιασμός και η κατανομή του βακτηρίου κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης της γαμετικής σειράς της μύγας, σε διαφορετικούς γενετικούς συνδυασμούς ξενιστή-παρασίτου. Παρατηρήθηκε αξιόλογη ετερογένεια, τόσο ανάμεσα στο ίδιο στέλεχος, όσο και ανάμεσα στα διαφορετικά στελέχη. Από τη σύγκριση της συμπεριφοράς ενός συγκεκριμένου βακτηριακού στελέχους σε διαφορετικά γενετικά υπόβαθρα ξενιστή και διαφορετικών στελεχών στον ίδιο ξενιστή, βγαίνουν ενδιαφέροντα συμπεράσματα για τη φύση των παραγόντων, που επηρεάζουν τα επίπεδα της ασυμβατότητας και γενικότερα για την εξέλιξη των σχέσεων ξενιστή-παρασίτου. Έτσι φαίνεται η ικανότητα πρόκλησης ασυμβατότητας να είναι εγγενής ιδιότητα του βακτηρίου, με κάποια στελέχη να την έχουν χάσει. Στα στελέχη που τη διαθέτουν, η ένταση του φαινοτύπου είναι ανάλογη της ποσότητας των βακτηρίων στα σπερματικά κύτταρα, η οποία ελέγχεται από τον ξενιστή. Από εξελικτική σκοπιά, η συνεξέλιξη ξενιστή-παρασίτου φαίνεται να οδηγεί σε χαμηλά επίπεδα ασυμβατότητας, υψηλή μητρική μετάδοση και χαμηλό κόστος της μόλυνσης, παράγοντες αλληλένδετοι με την πυκνότητα των βακτηρίων στους ιστούς-στόχους. Xρειάζεται πλήρης κατανόηση του μοριακού μηχανισμού όμως, για να διαλευκανθούν οι βαθύτερες σχέσεις μεταξύ της αναπτυξιακής δυναμικής των μολύνσεων και της αλληλεπίδρασης ξενιστή-παρασίτου στη ρύθμιση των βακτηριακών αριθμών.