Ανάπτυξη και συγκριτική αξιολόγηση νέων μεθόδων για τον μη επεμβατικό οπτικό χαρακτηρισμό και την ανάλυση φυσιολογικών και παθολογικών νευρικών ιστών

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is characterized by inflammation and demyelinating lesions in white matter (WM) of the central nervous system (CNS), leading to permanent neurological disabilities (sensory and motor deficiencies). Research on MS has been performed mainly with the aid of the experimental allergic encephalomyelitis (EAE) mouse model.Current diagnostic imaging of myelin alterations is conducted using microscopy of fixed tissue or a variety of modern methods. Fluorescence microscopy is a powerful diagnostic tool, which is usually coupled to immunofluorescence techniques, using the highly specific binding of an antibody to its antigen for labelling specific cellular proteins or other molecules within the cell. This method requires the administration of fluorescent dyes. Unfortunatelly, many of them tend to disrupt the lipid structure of myelin, while considerable shrinkage of myelin sheaths may take place after fixation and dehydration. Moreover, fluorophores are usually expensive and may lose their ability to fluoresce, due to their chemical deterioration under high-power light limiting the examination time of the sample.A variety of other modern optical methods (coherent anti-stokes raman scattering, CARS; third harmonic generation microscopy) have been used to image neuronal status, axonal alterations, or immune cell trafficking in the EAE mice. Although these imaging systems and methods are quite powerful to detect abnormal areas during MS and EAE, they are expensive, not portable and complicated. Therefore, laser energy and power onto the sample have to be optimized in order to achieve maximum penetration depth of light into the tissue under examination, without affecting the sample.Spectral imaging is a method which combines two well-established technologies, spectroscopy and imaging. Spectral imaging results in the collection of a three-dimensional data set, consisting of an image group, through the use of the same specimen field, acquired at different wavelength bands. An important advantage of spectral imaging is that it enables the inspection at narrow spectral bands, along a wide spectral range, permitting the direct assessment of invisible or low-contrast features of diagnostic importance. Additionally, it permits the measurement of the spectrum at each point or area of the image. An optimum set-up for the acquisition of multiple spectral images is the coupling of imaging detectors to monochromators. Imaging spectroscopy is generally performed with custom-built instruments due to the lack of commercial instrumentation.In the present work, a custom-made imaging monochromator coupled to a commercial microscope is used in order to evaluate spinal cord myelin damage. The critical component of the system is an interference filter wheel-based imaging monochromator. The monochromator incorporates a 5 MPixel monochrome CMOS sensor [complementary metal–oxide semiconductor (CMOS)] with 24 interference filters covering the spectral range from visible (400 nm) to near-infrared (1200 nm). The system is sensitive in low light conditions and is easily monitored by the end-user. The developed software is designed in LabView (National Instruments) programming interface and is used for the calibration of the system, for the control of the camera and monochromator and for the spectral image capturing and analysis. The system operates in two modes: spectroscopic and spectrometric. The spectroscopic mode enables the real-time visualization of desired spectral images while the spectrometric mode performs synchronized spectral scanning, image capturing and calculation of a full spectrum per image pixel. The above-mentioned procedures (real-time visualization, spectral scanning, image capturing and calculation of the spectra) are controlled through the software. EAE was induced in female C57BL/6 (B6) mice (6–10 weeks) by immunization with 100 mg MOG35–55 peptide emulsified in complete Freud’s adjuvant (CFA Sigma) s.c. at the base of the tail, and i.p. injections of 200 ng pertussis toxin (Sigma) at the time of immunization and 48 h later. Mice reaching clinical score 3–4, ten (10) days after immunization were introduced in the study. Five female C57/BL6 mice were used as control-naive mice. Sections of 40 or 50 μm sections were cut longitudinally in a vibratome. The sections were incubated with anti-myelin basic protein (anti-MBP) antibody 1:500 (ab980; Chemicon) and anti-cluster of differentiation 3 (anti-CD3) antibody (eBiosciences, purified rat anti-mouse CD3), followed by incubation with secondary antibodies (Alexa Fluor 488, and 633, Invitrogen) 1:1000 in TBST. Finally, samples were coverslipped using Antifade Gold with DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen).Before of each measurement set, the multispectral imaging microscope system is calibrated. After its successful calibration, spinal cord tissue is scanned for lesion sites and the demyelinated areas are marked and cross-checked with conventional fluorescent imaging methods. Analysis of the collected data show that the differential parameter (DP(λ)) is a significant, wavelength dependent, diagnostic parameter indicating areas with myelin loss. DP(λ) is estimated for each wavelength range of observation. Observation and analysis time, including calibration, lasts for a few minutes.Tissue imaging with multispectral imaging microscope shows that the backscattered signal is increased in the WM because of the abundant numbers of myelinated axons, while anterior horn neuron cell bodies and dendrites show low reflectance. Moreover, the boundaries between white and grey matter of the spinal cord are clearly depicted. Through selective imaging, the tissue becomes gradually transparent at long wavelengths (infrared spectral region), with the limits between WM and GM hardly detectable in images captured at wavelengths over 800nm.DAPI is an intrinsically fluorescent stain, which binds the DNA, thus labelling nucleated cells. The density of the fluorescent molecules is increased in a lesioned area, indicating elevated inflammatory cell numbers from the invasion of immune cells, for example, after induction of the autoimmune reaction and permeabilization of the blood–brain barrier with pertussis toxin to facilitate entry of activated immune cells within the CNS. In addition to the use of DAPI as a fluorescent stain, the use of fluorescent antibodies against MBP is also informative. Indeed, MBP is a major component of myelin, which surrounds the axons of neurons in the CNS. The area of the lesion is depicted by a lower MBP fluorescent signal, indicating decreased levels of myelin, presented as black holes (arrows) in the fluorescent background. Staining of spinal cord sections with antibodies against the CD3 antigen, a marker of T lymphocytes in inflamed areas, shows the infiltration of these immune cells associated with myelin loss. The different reflectance between the normal and the lesioned tissue is clearly depicted in images captured with multispectral imaging system. The accuracy of our system to detect areas with myelin loss was accurate with that of the gold-standard method of immunofluorescence microscopy, through comparative imaging of the same lesions with our microscope system. At the area of the lesion, the backscattered signal is minimized and the area is demonstrated as a black hole in a significantly lighter background. Comparison of the images captured with a fluorescence microscope and multispectral imaging microscope system clearly shows that the latter accurately detects the area of the lesion.At the area of the lesion, accumulations of infiltrated cells displace the neighbouring myelinated fibres, and the sheaths of the myelin are disrupted and dilated, resulting in illusive demyelination. It is thus possible that loss of the backscattered signal is attributed to the loss of reflectivity of myelin, to the existence of the concentrated inflammatory cells of the immune response which absorb the incident light, and to the increased density of inflamed blood vessels. A part of the incident light is transmitted directly to the area of the lesion almost unaffected by the damaged myelin fibres, and another part is backscattered depending upon the absorption coefficient and concentration of the accumulated cells and blood vessels within the lesion. Consequently, the area of the lesion loses the prominent reflectance signal shown in the normal WM. The morphology of the area with myelin loss detected with conventional imaging methods is comparable to that obtained with our system.The estimation of the DP(λ) parameter indicates that the maximum discrimination between damaged and normal areas is shown at 500nm. Spectral differences observed between normal and lesioned WM reflect the different densities of various tissue structures and compositions. Indeed, at the area of the lesion, myelin sheaths are dilated/destroyed, thus incident light is less scattered. Comparison of our method to classical immunofluorescence microscopy methods shows that the sensitivity of our system to detect spinal cord areas with myelin loss is 90.4% and the positive predictive value is 92.2%.In the last experimental part of this study, the multispectral imaging method is applied for the detection of the destruction of the retina layers of the mouse eye induced through AMPA excitotoxicity. The selective imaging of sections of the control mice (PBS) shows that the retina layers have different spectral and imaging characteristics the one from other. The characteristics of the backscattered signal are altered in the case of induced excitotoxicity and the control group. The backscattered signal of the multispectral imaging at slices with AMPA is almost lost and this phenomenon is associated with partial or complete necrosis of the cells.

Η σκλήρυνση κατά πλάκας (ΣκΠ) χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη φλεγμονής και την παρουσία απομυελινωμένων βλαβών κυρίως στη λευκή ουσία (WM: white matter) του κεντρικού νευρικού συστήματος (CNS), κατάσταση που οδηγεί σε μόνιμη νευρολογική αναπηρία (αισθητηριακή και κινητική). Η έρευνα για τη ΣκΠ πραγματοποιείται κυρίως με τη βοήθεια του μοντέλου της πειραματικής αυτοάνοσης εγκεφαλομυελίτιδας (experimental allergic encephalomyelitis, ΕΑΕ) σε ποντίκια.Οι τρέχουσες διαγνωστικές απεικόνισης των αλλοιώσεων της μυελίνης βασίζονται είτε στη μικροσκοπία μονιμοποιημένων ιστών είτε σε μια ποικιλία σύγχρονων μεθόδων. Η μικροσκοπία του φθορισμού είναι ένα ισχυρό διαγνωστικό εργαλείο, το οποίο συνήθως συνοδεύεται με τεχνικές ανοσοφθορισμού. Κατά την τεχνική αυτή χρησιμοποιείται ένα αντισώμα υψηλής ειδίκευσης σε κάποιο στο αντιγόνο, για την επισήμανση συγκεκριμένων κυτταρικών πρωτεϊνών ή άλλων μορίων μέσα στο κύτταρο. Αυτή η μέθοδος απαιτεί τη χορήγηση φθοριζουσών χρωστικών. Δυστυχώς, πολλοί από αυτούς τους δείκτες έχουν την τάση να διαταράσσουν τη δομή των λιπιδίων της μυελίνης, ενώ μπορεί να συμβεί και ουσιαστική συρρίκνωση των ινών της κατά τη διαδικασία της σταθεροποίησης και της αφαίρεσης του νερού. Επιπλέον, οι φθορίζουσες ουσίες που χρησιμοποιούνται είναι συνήθως ακριβές και μπορεί να υποστούν χημική φθορά και να χάσουν την ικανότητά τους να φθορίζουν, αν ακτινοβοληθούν με φως υψηλής ισχύος, πράγμα που περιορίζει αυτόματα το χρόνο εξέτασης του δείγματος.Μια ποικιλία σύγχρονων οπτικών μεθόδων (coherent anti-stokes raman scattering, CARS; third harmonic generation microscopy) έχει χρησιμοποιηθεί για την απεικόνιση της κατάστασης των νευρώνων, των αλλοιώσεων των αξόνων, ή της διήθησης των ανοσοκυττάρων σε ποντίκια που έχει επαχθεί η ΕΑΕ. Αν και αυτά τα συστήματα απεικόνισης και οι εφαρμοζόμενες μέθοδοι είναι αρκετά ελπιδιφόρα για την ανιχνεύση των αλλοιωμένων περιοχών κατά τη διάρκεια της ΣκΠ και της ΕΑΕ, έχουν υψηλό κόστος αφοράς και συντήρησης, ενώ είναι ογκώδη, μη φορητά και περίπλοκα στη χρήση τους. Επιπλέον, η ενέργεια και η ισχύς του φωτός λέιζερ που πέφτει πάνω στο δείγμα πρέπει να ρυθμιστεί προσεκτικά, προκειμένου να επιτευχθεί αφ’ ενός το μέγιστο βάθος διείσδυσης του φωτός μέσα στον υπό εξέταση ιστό και αφ΄ετέρου να μην αλλοιωθεί το δείγμα.Η φασματική απεικόνισης είναι μια μέθοδος η οποία συνδυάζει τις δύο καθιερωμένες τεχνολογίες, της φασματοσκοπίας και της απεικόνισης. Το αποτέλεσμα της εφαρμογής της φασματικής απεικόνισης είναι η συλλογή ενός τρισδιάστατου σύνολου δεδομένων, που αποτελείται από ένα σύνολο εικόνων του δείγματος, που αποκτήθηκες με απεικόνιση σε διαφορετικές φασματικές ζώνες. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα της φασματικής απεικόνισης είναι ότι επιτρέπει την λεπτομερή επιθεώρηση των χαρακτηριστικών του δείγματος σε στενές φασματικές ζώνες, κατά μήκος μιας ευρείας φασματικής περιοχής. Αυτό επιτρέπει την ανάδειξη και την άμεση αξιολόγηση των «αόρατων» χαρακτηριστικών του δείγματος ή εκείνων των χαρακτηριστικών που εμφανίζουν χαμηλή αντίθεση. Επιπλέον, η φασματική απεικόνιση επιτρέπει τη μέτρηση του φάσματος σε κάθε σημείο ή περιοχή της εικόνας. Μια βασική διάταξη υλοποίησης της φασματικής απεικόνισης βασίζεται στη σύζευξη των ανιχνευτών απεικόνισης με τους μονοχρωμάτορες. Λόγω της έλλειψης οργάνων που να κυκλοφορούν στο εμπόριο, η φασματοσκοπία απεικόνισης πραγματοποιείται γενικά με αναπτυχθέντα συστήματα επί σκοπώ.Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιείται ένας αναπτυχθέντας μονοχρωμάτορας απεικόνισης σε συνδυασμό με ένα εμπορικό μικροσκόπιο, προκειμένου να αξιολογηθούν βλάβες μυελίνης στο νωτιαίο μυελού ποντικιών. Το βασικό συστατικό του συστήματος είναι ένας μονοχρωμάτορας απεικόνισης που συνίσταται από ένα περιστρεφόμενο δίκσο πάνω στον οποίο έχουν προσαρτηθεί διάφορα φίλτρα διέλευσης του φωτός. Ο μονοχρωμάτορας είναι ενσωματωμένος με ένα μονόχρωμο CMOS αισθητήρα των 5 MPixel [complementary metal–oxide semiconductor (CMOS)] και περιλαμβάνει 24 φίλτρα παρεμβολής που καλύπτουν τη φασματική περιοχή του ορατού (400 nm) για τους εγγύς υπερύθρου (1200 nm). Το σύστημα είναι ευαίσθητο σε συνθήκες χαμηλού φωτισμού και είναι εύκολο στη χρήση του από οποιοδήποτε χρήστη. Το ανεπτυγμένο λογισμικό είναι σχεδιασμένο σε LabView (National Instruments) περιβάλλον προγραμματισμού και χρησιμοποιείται για τη βαθμονόμηση του συστήματος, για τον έλεγχο της κάμερας και του μονοχρωμάτορα αλλά και για τη λήψη και ανάλυση των φασματικών εικόνων.Το σύστημα λειτουργεί με δύο τρόπους: φασματοσκοπικά και φασματομετριτικά. Ο φασματοσκοπικός τρόπος λειτουργίας επιτρέπει την προβολή, σε πραγματικό χρόνο, των επιθυμητών φασματικών εικόνων, ενώ κατά τον φασματομετριτικό τρόπο λειτουργίας εκτελείται συγχρονισμένη φασματική σάρωση, η αποθήκευση των εικόνων και ο υπολογισμός ενός πλήρους φάσμα ανά εικονοστοιχείο. Οι προααναφερθείσες διαδικασίες (απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο, φασματική σάρωση, η αποθήκευση των εικόνων και ο υπολογισμός των φασμάτων) ελέγχονται μέσω του λογισμικού.Η ΕΑΕ επάχθηκε σε θηλυκά ποντίκια C57BL/6 (B6) (6-10 εβδομάδων). H ανοσοποίηση έγινε με 100 mg πεπτιδίου MOG35-55 γαλακτωματοποιημένου σε ανοσοενισχυτικό του Freud (CFA Freud’s adjuvant, Sigma) χορηγούμενο υποδόρια, στη βάση της ουράς, καθώς και με ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις των 200ng τοξίνη του κοκκύτη (Sigma) κατά το χρόνο της ανοσοποίησης και 48 ώρες αργότερα. Για τη μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια που 10 ημέρες μετά την ανοσοποίηση κατέληξαν στην κλινική βαθμολογία 3-4. Πέντε θηλυκά ποντίκια C57/BL6 χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου και τα οποία ανοσοποιήθηκαν μόνο με το CFA και την τοξίνη του κοκκύτη. Τομές των 40 ή 50μm κόπηκαν με κρυοτόμο, κατά μήκος της σπονδυλικής στήλης. Οι τομές εμποτίστηκαν με το αντίσωμα της βασικής πρωτεΐνης της μυελίνης, anti-ΜΒΡ 1:500 (ab980; Chemicon), το αντίσωμα anti-cluster of differentiation 3 (anti-CD3, ebiosciences purified Rat anti-mouse CD3) και τέλος με δευτερογενή αντισώματα (Alexa Fluor 488, and 633; 1:1000 σε TBST 0.1%). Τέλος τα δείγματα επικαλύφθηκαν με Antifade Gold με DAPI (Invitrogen). Πριν την ένερξη οποιουδήποτε συνόλου μετρήσεων, το πολυφασματικό μικροσκόπιο βαθμονομείται. Μετά την επιτυχημένη ολοκλήρωση της διαδικασίας της βαθμονόμισής του, οι τομές του νευρικού ιστού από το νωτιαίο μυελό των ποντικιών σαρώνονται προκειμένου να εντοπιστούν πιθανές αλλοιώσεις και οι απομυελινωμένες περιοχές σημειώνονται και ελέγχονται μία προς μία αντίστοιχα με τις συμβατικές απεικονιστικές μεθόδους του ανοσοφθορισμού. Η ανάλυση των δεδομένων που συλλέγθηκαν έδειξε ότι η παράμετρος διαφοροποίησης της έντασης, ΠΔΕ(λ) είναι μια σημαντική διαγνωστική παράμετρος που εξαρτάται από τη φασματική περιοχή μελέτης και εντοπίζει τις περιοχές που έχουν υποστεί απώλεια στη μυελίνη. Η ΠΔΕ(λ) υπολογίστηκε και κάθε φασματική περιοχή παρατήρησης. Η όλη διαδικασία σάρωσης του δείγματος, ανάλυσης και εξαγωγής των αποτελεσμάτων διαρκεί μόλις λίγα λεπτά. Η πολυφασματική απεικόνιση του ιστού δείχνει ότι το οπισθοσκεδαζόμενο σήμα αυξάνεται στην περιοχή της λευκής ουσίας λόγω του μεγάλου αριθμούς των μυελινωμένων νευροαξόνων, ενώ τα σώματα των νευρικών κυττάρων και οι δενδρίτες παρουσιάζουν χαμηλή ανάκλαση. Επιπλέον, τα όρια μεταξύ της λευκής και της φαιάς ουσίας του νωτιαίου μυελού απεικονίζονται ευκρινώς σε αρκετές φασματικές ζώνες. Ο ιστός γίνεται σταδιακά διαφανής σε μεγάλα μήκη κύματος (υπέρυθρη περιοχή του φάσματος), με τα όρια μεταξύ λευκής και φαιάς ουσίας να γίνονται δύσκολα ανιχνεύσιμα στις εικόνες που αντιστοιχούν σε ζώνες άνω των 800nm.Το DAPI είναι μία εγγενώς φθορίζουσα χρωστική, η οποία δεσμεύεται στο DNA, και αναδεικνύει τα εμπύρηνα κύτταρα. Η πυκνότητα των φθοριζόντων μορίων είναι αυξημένη στις περιοχές που παρουσιάζουν αλλοίωση, υποδεικνύοντας τον αυξημένο αριθμό εμπύρηνων κυττάρων. Η επαγωγή της αυτοάνοσης αντίδρασης και η αύξηση της διαπερατότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού που επάγεται η χορήγηση της τοξίνης του κοκκύτη επιφέρουν την είσοδο των ενεργοποιημένων κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος εντός του ΚΝΣ. Εκτός από τη χρήση του DΑΡΙ ως φθορίζουσας χρωστικής έγινε και απεικόνιση του φθορισμού του αντισώματος της ΜΒΡ (βασική πρωτεϊνη της μυελίνης). Πράγματι, η ΜΒΡ είναι ένα σημαντικό συστατικό της μυελίνης, η οποία περιβάλλει τους άξονες των νευρώνων στο ΚΝΣ. Η περιοχή της αλλοίωσης χαρακτηρίζεται από ένα χαμηλότερο σήμα φθορισμού του anti-ΜΒΡ, υποδεικνύοντας τα μειωμένα επίπεδα της μυελίνης σε ορισμένες περιοχές που παρουσιάζονται ως μαύρες τρύπες που περιβάλλονται από ένα φθορίζον φόντο. Προκειμένου να γίνει ταυτοποίηση των εμπύρηνων κυττάρων που συγκεντρώθηκαν στην περιοχή της βλάβης, έγινε χρώση των τομών του νωτιαίου μυελού με αντισώματα έναντι του αντιγόνου CD3. Το CD3 είναι ένας ειδικότατος δείκτης των Τ-λεμφοκυττάρων σε αλλοιωμένες περιοχές και δείχνει την διείσδυση αυτών των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος που σχετίζονται με την απώλεια της μυελίνης. Η διαφορετική ανακλαστικότητα μεταξύ της κανονικής και της αλλοιωμένης περιοχής αποτυπώθηκε ξεκάθαρα και στις εικόνες που συλλέχθηκαν με το σύστημα της πολυφασματικής απεικόνισης.Η αποτελεσματικότητα του συστήματος της πολυφασματικής απεικόνισης στην ανίχνευση περιοχών που παρουσιάζουν απώλεια μυελίνης ελέγθηκε μέσω της συγκριτικής απεικόνισης των ίδιων αλλοιώσεων με το πολυφασματικό σύστημα μικροσκοπίου και με τα μικροσκόπια και τις μεθόδους του ανοσοφθορισμού. Στις εικόνες του πολυφασματικού μικροσκοπίου, στην περιοχή της βλάβης, το οπισθοσκεδαζόμενο σήμα ελαχιστοποιείται και η περιοχή απεικονίζεται ως μια μαύρη τρύπα σε ένα σημαντικά ανοιχτόχρωμο φόντο. Η σύγκριση των εικόνων που συλλέγονται με το μικροσκόπιο του φθορισμού και του συστήματος της πολυφασματικής απεικόνισης δείχνει σαφώς ότι η τελευταία μέθοσος ανιχνεύει με ακρίβεια την έκταση της βλάβης.Στην περιοχή της βλάβης τα συσσωρευμένα κυττάρα που έχουν διεισδύσει εκτοπίζουν τις γειτονικές εμμύελες ίνες, και τα έλυτρα της μυελίνης διαταράσσονται και διαστέλονται, με αποτέλεσμα την εμφάνιση μιας εικόνας απομυελίνωσης. Είναι έτσι δυνατόν η απώλεια του σήματος της οπισθοσκεδαζόμενης ακτινοβολίας να αποδοθεί στην απώλεια της ανακλαστικότητας των ινών της μυελίνης, στην ύπαρξη των συγκεντρωμένων φλεγμονωδών κυττάρων της ανοσολογικής απόκρισης τα οποία απορροφούν το προσπίπτον φως, και στην αυξημένη πυκνότητα των αιμοφόρων αγγείων. Ένα μέρος του προσπίπτοντος φωτός περνάει απευθείας μέσα από την περιοχή της βλάβης σχεδόν ανεπηρέαστο από τις κατεστραμμένες ίνες της μυελίνης, και ένα άλλο μέρος οπισθοσκεδάζεται ανάλογα με τον συντελεστή απορρόφησης και την συγκέντρωση των συσσωρευμένων κυττάρων και των αιμοφόρων αγγείων εντός της βλάβης. Κατά συνέπεια, η περιοχή της βλάβης χάνει το ιδιαίτερο σήμα ανάκλασης που εμφανίζεται στην άθικτη λευκή ουσία. Η μορφολογία της περιοχής που παρουσιάζει απώλεια μυελίνης και που ανιχνεύεται με τις συμβατικές μεθόδους απεικόνισης είναι συγκρίσιμη με εκείνη που λαμβάνεται με το πολυφασματικό σύστημα.Ο υπολογισμός της παραμέτρου διαφοροποίησης της έντασης, ΠΔΕ(λ) υποδεικνύει ότι η μέγιστη διάκριση μεταξύ καταστραμμένων και άθικτων περιοχών επιτυγχάνεται με απεικόνιση του ιστού στη φασματική ζώνη των 500 nm. Οι φασματικές διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ των κανονικών και των αλλοιωμένων περιοχών αντικατοπτρίζουν τις διαφορετικές πυκνότητες και τη διαφορετική σύσταση των ιστών στις περιοχές αυτές. Πράγματι, στην περιοχή της βλάβης, τα έλυτρα μυελίνης είναι διεσταλμένα/κατεστραμένα και επομένως η προσπίπτουσα ακτινοβολία παρουσιάζει μικρότερη διασπορά.Τέλος, η σύγκριση της αναπτυχθήσας μεθόδου με τις κλασικές μεθόδους ανοσοφθορισμού δείχνει ότι η ευαισθησία του πολυφασματικού συστήματος για την ανίχνευση περιοχών του νωτιαίου μυελού με απώλεια μυελίνης είναι 90,4% και η θετική προγνωστική αξία είναι 92,2%.Στο τελευταίο πειραματικό κομμάτι της παρούσας διατριβής έγινε εφαρμογή της πολυφασματικής απεικόνισης στην ανίχνευση της καταστροφής των στιβάδων του αμφιβληστροειδή χιτώνα του ματιού ποντικιών κατόπιν επαγωγής τοξικότητας με τη χορήγηση ΑΜΡΑ. Με επιλεκτική απεικόνιση των τομών των ποντικιών που αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου (PBS) φάνηκε ότι οι στιβάδες του αμφιβληστροειδή χιτώνα έχουν διαφορετικά φασματικά χαρακτηριστικά μεταξύ τους, μέσω της καταγραφής του οπισθοσκεδαζόμενου φωτός από αυτές. Τα φασματικά χαρακτηριστικά αυτά αλλοιώνονται στην περίπτωση τομών στις οποίες επάχθηκε τοξικότητα, με φυσική συνέπεια η σχεδόν ολική απώλεια του οπισθοσκεδαζόμενου σήματος της πολυφασματικής απεικόνισης να σχετιστεί με την μερική ή ολική νέκρωση των κυττάρων.