Φυτοχημικά συστατικά των φύλλων του Vaccinium corymbosum και των στύλων του Crocus sativus για την αντιμετώπιση του καταρράκτη και άλλων σελήνιο-επαγομένων οξειδωτικών βλαβών

Abstract

Sodium selenite (Na2SeO3) consumption at low concentrations is considered beneficial as selenium is part of several enzymes. However, when consumed at high concentrations, selenite induces significant oxidative damages. Most typical is the formation of ocular cataract in the crystalline lenses of neonatal rats (until 14 days old). Based on this observation, an in vivo experimental model was established, 40 years ago, and it has been used in order to understand the underlying mechanisms of cataractogenesis and to investigate agents with the potential to prevent or treat cataract, including many natural products. Interestingly, the same dose of selenite is lethal when administered to adult animals. The observed resistance of neonates has not been thoroughly investigated until today. In traditional medicine, the extracts of Crocus sativus styles and of the leaves of several taxa of Vaccinium sp. were used for the treatment of ocular diseases. In a previous study of our group, we have shown that the administration of saffron styles extract to neonatal rats inhibits cataract formation. In the current study, we aimed to the investigation of the anticataractogenic action of blueberry leaf decoction (BLD) and we studied the activity and the mechanism of action of the principle components of V. corymbosum leaves and C. sativus styles for the identification of bioactive compounds. First, we examined the composition and the in vitro antioxidant activity of the two extracts. The HPLC-DAD chromatographic analysis and the determination of the phenolic composition showed that BLD, as well as its fractions (AcOEt, BuOH, Aqueous) which have been produced after consecutive extractions with acetic ethylester and butanol, are rich sources of hydroxycinnamic acids, such as chlorogenic acid, and flavonols, such as hyperoside, rutin, isoquercetin and quercetin. Neither BLD, nor its fractions contained anthocyanins. The in vitro antioxidant activity of BLD and its fractions was examined with three different methods. The different composition of the fractions resulted to differential antioxidant response, however in total, blueberry leaf decoction is a powerful antioxidant agent in vitro, as it scavenges DPPH∙ free radical, it reduces ferric cation and it chelates iron. Methanolic extract of saffron contains, as previously demonstrated, mainly trans- and cis- crocins; thus in this study we only determined the contentration of total crocins in our extract. The investigation of its antioxidant activity showed that saffron extract is a moderate antioxidant agent, besides crocetin’s strong scavenging activity. However, saffron extract is a strong chelating agent, stronger even than BLD. In order to investigate the in vivo action of blueberry leaf decoction against cataract formation neonatal Wistar rats were randomly assigned to three groups: group ‘Se’, which received i.p. injection of 20μmol Na2SeO3/kg b.w. on post natal (PN) day 10, group ‘SeBLD’, which received the same i.p. injection of selenite on PN 10 and subcutaneous injection of 100 mg dry BLD extract/kg b.w. on PN days 11 and 12 and group ‘C’, which received injections of normal saline. Cataract staging was performed on PN day 21 using isolated rat pups lenses and showed that BLD administration had successfully inhibited lens cloudiness (group Se: cataract stage 4 and group SeBLD: cataract stage 1). The determination of the activity of the antioxidant enzymes SOD, CAT, GPx, of the glutathione content as well as of lipid peroxidation products and protein oxidation levels showed that BLD possesses significant anticataractogenic activity; it preserved the oxidative equilibrium of the crystalline lenses and it prevented low molecular proteins lysis and aggregation. Using the afore-mentioned model, we got the chance to investigate the effects of the toxic dose of selenite, as well as of the blueberry leaf decoction on the oxidative status and the proteolytic activity of liver and of the cerebral tissues: cortex, midbrain and cerebellum of neonatal rats. The determination of the antioxidant activity of several enzymes and small molecules and the levels of lipid peroxidation showed that selenite did not induce significant oxidative damage to the tissues, even at this highly toxic dose. Tissue-specific, moderate disturbances were recored in liver and cerebral cortex. Midbrain was slightly affected, while cerebellum was unaffected. It seems like the endogenous antioxidant system, which is reinforced during the first days of life, protects effectively the tissues from the selenite oxidative insult, possibly explaining the resilience of rat pups. We, also, showed that BLD acted as a powerful exogenous antioxidant agent, protecting the affected tissues from the selenite-induced damages and reinforcing the antioxidant defense of those that were not affected by selenite. In the in vitro study, we investigated the main underlying mechanisms of action of the main compounds of BLD for the prevention of cataract. Our results showed that the glycosides rutin, hyperoside and isoquercetin inhibit at μΜ concentrations μ-calpain activity. Moreover, the changes of quercetin spectrum in UV-Vis titration experiments show that this compound is oxidized by the selenite ions, forming para-quinonomethides, while weak interactions have been recorded between quercetin and calcium ions. The above results were reflected on the successful inhibition of selenite- and calcium-induced turbidity of the porcine lenses homogenates in vitro. Quercetin was the strongest inhibitor, while its glycosides and chlorogenic acid were less effective. The in vitro investigation of trans-crocetin mechanism of action, main metabolite of crocins which are contained in saffron extract demonstrated that crocetin is the most powerful μ-calpain inhibitor (IC50 145 nM) among the tested natural compounds, its alkene backbone interacts, possibly via covalent binding, with selenite ions, it develops weak interations with calcium ions and it inhibits effectively the selenite- and calcium-induced turbidity of porcine lenses. Thus, the in vitro results explain the previously described beneficial action of saffron extract in vivo and reveal an interesting lead compound. In conclusion, mainly quercetin, but also crocetin in lesser degree, intervene in three molecular paths that lead to cataract formation: they eliminate selenite-induced protein oxidation, they indirectly obstruct the calcium-induced activation of calpains and they directly inhibit calpain activation, thus preventing crystallins proteolysis. This Ph.D. thesis reveals the potential of polyphenols in Vaccinium corymbosum leaves and of the apocarotenoids in saffron styles to prevent/treat ocular cataract and oxidative damages.

Το σεληνιώδες νάτριο (Na2SeO3), μια ανόργανη ένωση του σεληνίου, όταν λαμβάνεται σε χαμηλές συγκεντρώσεις λειτουργεί ευεργετικά, αφού το σελήνιο είναι συστατικό αρκετών ενζύμων. Η χορήγησή του, όμως, σε μεγάλες συγκεντρώσεις επάγει σημαντικές οξειδωτικές βλάβες – όταν χορηγηθεί σε αναπτυσσόμενους επίμυες επάγει το σχηματισμό οφθαλμικού καταρράκτη. Σχεδόν τα τελευταία 40 χρόνια έχει αναπτυχθεί ένα in vivo πειραματικό μοντέλο, βάσει αυτής της παρατήρησης, το οποίο έχει χρησιμεύσει τόσο στην κατανόηση των μηχανισμών της καταρρακτογένεσης όσο και στη διερεύνηση δυνητικών αντικαταρρακτογόνων παραγόντων, μεταξύ των οποίων πολλά φυσικά προϊόντα. Ωστόσο, όταν οι ίδιες δόσεις χορηγούνται σε ενήλικα πειραματόζωα είναι θανατηφόρες. Η ανθεκτικότητα των νεογνών επίμυων δεν έχει μέχρι σήμερα εξηγηθεί. Στην παραδοσιακή θεραπευτική το εκχύλισμα των στύλων του Crocus sativus και των φύλλων διαφόρων taxa του γένους Vaccinium χρησιμοποιούνταν για την αντιμετώπιση οφθαλμικών νόσων. Σε προηγούμενη μελέτη της ερευνητικής μας ομάδας εδείχθη ότι η χορήγηση του εκχυλίσματος κρόκου στους επίμυες εμποδίζει την εμφάνιση καταρράκτη. Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν να διερευνηθεί η αντικαταρρακτογόνος δυνατότητα του εκχυλίσματος των φύλλων μύρτιλλων και να μελετηθεί η δραστικότητα και ο μηχανισμός δράσης των κυριότερων συστατικών των φύλλων του Vaccinum corymbosum και των στύλων του Crocus sativus με απώτερο στόχο την ταυτοποίηση βιοδραστικών ενώσεων. Αρχικά, προσδιορίσαμε τη σύσταση και τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες των δυο εκχυλισμάτων. Η HPLC-DAD χρωματογραφική ανάλυση και ο αδρός ποσοτικός προσδιορισμός των φαινολικών συστατικών έδειξαν ότι τόσο το ολικό έγχυμα του Vaccinium corymbosum (BLD) όσο και τα κλάσματά του (AcΟEt, BuOH, Aqueous), που προέκυψαν από διαδοχικές εκχυλίσεις με οξικό αιθυλεστέρα και βουτανόλη, είναι πλούσια πηγή υδροξικινναμωμικών οξέων, όπως το χλωρογενικό οξύ και φλαβονολών όπως ο υπεροζίτης, η ρουτίνη, η ισοκερσετίνη και η κερσετίνη. Αξιοσημείωτη παρατήρηση είναι ότι αν και με πλούσιο φαινολικό περιεχόμενο, το BLD και τα κλάσματά του δεν περιέχουν ανθοκυανίνες. Η αντιοξειδωτική ικανότητα του BLD και των κλασμάτων του ελέγχθηκε με τρεις διαφορετικές μεθόδους. Η διαφορετική φαινολική σύσταση των κλασμάτων φαίνεται ότι επηρεάζει την αντιοξειδωτική τους ικανότητα όμως συνολικά διαπιστώσαμε ότι το έγχυμα είναι ένας πολύ ισχυρός αντιοξειδωτικός παράγοντας in vitro∙ σαρώνει αποτελεσματικά τη ρίζα του DPPH∙, ανάγει το κατιόν σιδήρου και δημιoυργεί χηλικά σύμπλοκα με το σίδηρο. Το μεθανολικό εκχύλισμα των στύλων του κρόκου είναι γνωστό από παλαιότερες μελέτες ότι περιλαμβάνει κυρίως trans- και cis-κροκίνες, επομένως στην παρούσα φάση ποσοτικοποιήσαμε αδρά μόνο το σύνολο των κροκινών. Η μελέτη της αντιοξειδωτικής ικανότητας του εκχυλίσματος κρόκου έδειξε ότι, παρά την ισχυρή ικανότητα σάρωσης ριζών από την κροκετίνη, το εκχύλισμα είναι μέτριος αντιοξειδωτικός παράγοντας πιθανόν λόγω της παρουσίας φαινολικών ενώσεων σε μικρές συγκεντρώσεις, δρα ωστόσο ως ισχυρός χηλικός παράγοντας, ισχυρότερος και από το BLD. Με σκοπο να μελετηθεί in vivo η αντικαταρρακτογόνος δράση του εκχυλίσματος των φύλλων μύρτιλλων, αναπτυσσόμενοι επίμυες Wistar χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες: ομάδα «Se» που έλαβε ενδοπεριτοναϊκά σεληνιώδες νάτριο (20μmol/kg σωματικού βάρους) τη 10η ημέρα της ζωής, ομάδα «SeBLD» που έλαβε ενδοπεριτοναϊκά 20μmol Na2SeO3/kg σωματικού βάρους τη 10η ημέρα της ζωής και υποδόρια 100mg ξηρού εκχυλίσματος BLD/kg σωματικού βάρους την 11η και τη 12η ημέρα της ζωής και ομάδα «C» που έλαβε φυσιολογικό ορό τις αντίστοιχες ημέρες. Η σταδιοποίηση του καταρράκτη, που πραγματοποιήθηκε στους απομονωμένους κρυσταλλικούς φακούς των πειραματόζωων την 21η ημέρα της ζωής, απέδειξε ότι το BLD είχε αναστείλει επιτυχώς την εμφάνιση θολερότητας (ομάδα Se: καταρράκτης σταδίου 4 και ομάδα SeBLD: καταρράκτης σταδίου 1). Ο προσδιορισμός της ενεργότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων SOD, CAT και GPx, των επιπέδων της γλουταθειόνης, της λιπιδικής υπεροξείδωσης και της οξείδωσης των –SH ομάδων των πρωτεϊνών στο φακό και η ανάλυση του πρωτεϊνικού περιεχομένου έδειξαν ότι το BLD είχε ισχυρή αντικαταρρακτογόνο δράση καθώς διατήρησε την οξειδοαναγωγική ισορροπία στους κρυσταλλικούς φακούς στα επίπεδα της ομάδας C και περιόρισε την πρωτεόλυση και συσσωμάτωση των πρωτεϊνών χαμηλού μοριακού μεγέθους που επάγονται από το Na2SeO3 και προκαλούν τη χαρακτηριστική θολερότητα του καταρρακτικού φακού. Με τη χρήση του ανωτέρω μοντέλου μας δόθηκε, επίσης, η ευκαιρία να διερευνήσουμε τις επιπτώσεις της τοξικής δοσολογίας του Na2SeO3 καθώς και την επίδραση του εγχύματος των φύλλων στην οξειδοαναγωγική κατάσταση και την πρωτεολυτική ικανότητα του ήπατος και των εγκεφαλικών περιοχών φλοιός, μεσεγκέφαλος και παρεγκεφαλίδα των αναπτυσσόμενων επίμυων. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων της ενεργότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων και μικρών μορίων καθώς της έκτασης της λιπιδικής υπεροξείδωσης έδειξαν ότι αν και η ένωση είναι ισχυρά τοξική προκαλεί ιστο-ειδικές και μέτριας έκτασης οξειδωτικές βλάβες στο ήπαρ και τον εγκεφαλικό φλοιό, ο μεσεγκέφαλος παραμένει σχεδόν ανεπηρέαστος και η παρεγκεφαλίδα δεν επηρεάζεται καθόλου. Φαίνεται ότι η ενδογενής αντιοξειδωτική άμυνα που είναι ενισχυμένη τις πρώτες ημέρες της ζωής κάθε οργανισμού, προστατεύει επιτυχώς από την τοξικότητα του σεληνίου δίνοντας μια εξήγηση της ανθεκτικότητας των αναπτυσσόμενων οργανισμών. Από την άλλη μεριά το έγχυμα έδρασε ως ισχυρός εξωγενής αντιοξειδωτικός παράγοντας, επαναφέροντας την ισορροπία στους διαταραγμένους ιστούς και ενισχύοντας την αντιοξειδωτική άμυνα όσων δε διαταράχθηκαν. Στην in-vitro μελέτη των κύριων μηχανισμών δράσης των επικρατέστερων συστατικών του BLD μέσω των οποίων προστατεύεται η ακεραιότητα των πρωτεϊνών του φακού, των οποίων η αποικοδόμηση επάγεται άμεσα ή έμμεσα από το σεληνιώδες νάτριο και οδηγεί στην καταρρακτογένεση, βρήκαμε ότι οι γλυκοζίτες ρουτίνη, υπεροζίτης και ισοκερσετίνη αναστέλουν σε επίπεδο μΜ την μ-καλπαϊνη. Από τις μεταβολές στο φάσμα της κερσετίνης κατά τη φωτομετρική τιτλοδότηση φαίνεται ότι αυτή οξειδώνεται πλήρως από τα ιόντα σεληνιώδους και αλληλεπιδρά ασθενώς με τα ιόντα ασβεστίου. Τα παραπάνω αντικατοπτρίστηκαν στην επιτυχημένη αναστολή της σεληνιο- και ασβεστιο-επαγόμενης θολερότητας στα ομογενοποιήματα των φακών χοίρων ενός in vitro πειραματικού μοντέλου. Η κερσετίνη ήταν ο ισχυρότερος αναστολέας, ενώ οι γλυκοζίτες της και το χλωρογενικό οξύ ήταν λιγότερο αποτελεσματικοί. Η in vitro διερεύνηση της δραστικότητας της κροκετίνης, κύριου μεταβολίτη των κροκινών που εμπεριέχονται στο εκχύλισμα των στύλων του C. sativus, απέδειξε ότι είναι εξίσου αποτελεσματικό φυσικό προϊόν από οσα μελετήθηκαν ερμηνεύοντας τα προηγούμενα θετικά in vivo αποτελέσματα. Είναι ισχυρότατος αναστολέας της μ-καλπαΐνης (IC50 145 nM), αναπτύσσει ασθενείς ηλεκτροστατικές έλξεις, πιθανότατα ομοιοπολικής φύσης, με τα ιόντα σεληνιώδους μέσω του ακόρεστου σκελετού, αλληλεπιδρά ασθενώς με τα ιόντα ασβεστίου και αναστέλλει σε ικανοποιητικό βαθμό τη σεληνιο- και ασβεστιο-επαγόμενη θολερότητα των πρωτεϊνών στο in vitro μοντέλο των κρυσταλλικών φακών χοίρων. Εν κατακλείδι, η κερσετίνη σε σημαντικότερο βαθμό και η κροκετίνη σε μικρότερο, παρεμβάλλονται σε τρια μοριακά μονοπάτια που οδηγούν σε καταρρακτογένεση: περιορίζουν την οξείδωση των πρωτεϊνών από το σεληνιώδες νάτριο, περιορίζουν την έμμεση ενεργοποίηση των καλπαϊνών με συμπλοκοποίηση των ιόντων ασβεστίου και αναστέλλουν άμεσα την μ-καλπαΐνη προλαμβάνοντας την πρωτεόλυση των κρυσταλλινών. Επομένως, στην παρούσα διατριβή αναδεικνύεται η πιθανή προληπτική/θεραπευτική αξία των πολυφαινολών των φύλλων του Vaccinium corymbosum και των αποκαροτενοειδών του κρόκου Κοζάνης έναντι του καταρράκτη και οξειδωτικών βλαβών.