Εφαρμογή της μοριακής αποτύπωσης στη στοχευμένη απομόνωση βιοδραστικών φυσικών ενώσεων για τη ρύθμιση της απόκρισης των κυττάρων στην υποξία

Abstract

Hypoxia Inducible Factor 1 (HIF-1) is a transcriptional factor highly involved in the pathology of cancer. HIF-1 inhibition retards tumor growth and enhances treatment efficiency when used in combination with chemo- or radiation therapy. The recent validation of HIF-1 as an important drug target in cancer treatment has stimulated efforts to identify and isolate natural or synthetic HIF-1 inhibitors. In the present study, quercetin, a known inhibitor of HIF-1, was imprinted in a polymer matrix in order to produce the 3D synthetic imitation of the quercetin action site in the HIF-1 signalling pathway. The Molecularly Imprinted Polymer (MIP), which contains functionalized cavities complementary in size, shape and functionality to the initial template (quercetin), was used for the selective isolation of new HIF-1 inhibitors from frankincense, a gum resin collected from the trees of the genus Boswellia that was used as anticancer remedy in Greek antiquity, traditional Chinese and Indian medicine. By the application of the frankincense acetone extract onto the lab made SPE catridge (packed with 45-90μm particles of the imprinted polymers) a number of compounds were selectively retained on the catridge with imprinting effect from 5±4 to 8±4,6 (with reference to non imprinted polymer, n=3). The mixture of compounds eluted from the catridge, efficiently inhibited the transcriptional activity of HIF-1 and decreased the protein levels of HIF-1α, the regulated subunit of HIF-1. On the contrary non-retained compouds did not have any inhibitory effect on HIF-1. Acetyl 11-ketoboswellic acid (AKBA), one of the main bioactive components of frankincense, was identified as one of the main components of the selectively retained fraction. Determination of the biological activity of AKBA, revealed that it inhibits HIF-1α induction and HIF-1 transcriptional activity. By subsequent semi-preparative fractionation of the acetone extract, AKBA was separated from the other selectively retained compounds. Interestingly, these compounds also exhibited inhibitory effect on HIF-1 transcriptional activity. Additionally the ATP analog tri-O-acetyladenosine was imprinted in order to produce the approximate synthetic imitation of the ATP binding cleft in kinases. Appropriate kinases are implicated in HIF-1α post-translational modification and their inhibition can negativily regulate HIF-1. Occupation of the ATP-binding cleft by ATP mimetic compounds is the main mechanism of kinase inhibition (ATP competitive mechanism). The production of the aproximate synthetic imitation of the ATP binding cleft could create a polymer suitable for screening and isolation of new protein kinases ATP-mimetic inhibitors from different sources. For this reason tri-O-acetyladenosine was successfully imprinted giving polymers with high affinity to the initial template (Kd as low as 1,2μΜ), sufficient concentration of binding sites N and pronounced specificity (k’imprinted >> k’ control). Overall, this study demonstrates the potential of MIP application in the screening, identification and isolation of new bioactive compounds that aim selected molecular targets, a potential that has been poorly appreciated until now.

Ο επαγόμενος από την υποξία μεταγραφικός παράγοντας 1 (HIF-1) εμπλέκεται σε σημαντικό βαθμό στην παθολογία του καρκίνου. Η αναστολή του HIF-1 επιβραδύνει την ανάπτυξη του όγκου και ενισχύει την αποτελεσματικότητα της αγωγής όταν συνδυάζεται με χημειο-ραδιο θεραπεία. Η πρόσφατη καθιέρωση του HIF-1 ως σημαντικού φαρμακευτικού στόχου στη θεραπεία του καρκίνου αποτέλεσε έναυσμα σειράς προσπαθειών για την ανεύρεση και απομόνωση αναστολέων του HIF-1, φυσικής ή συνθετικής προέλευσης. Στην παρούσα μελέτη, η κερκετίνη, ένας γνωστός αναστολέας του HIF-1, αποτυπώθηκε σε πολυμερική μήτρα προκειμένου να αναπαραχθεί η 3D συνθετική απομίμηση των σημείων/θέσεων δράσης της κερκετίνης στο σηματοδοτικό μονοπάτι του HIF-1. Το μοριακά αποτυπωμένο πολυμερές (MIP), το οποίο διαθέτει λειτουργικές κοιλότητες, συμπληρωματικές σε σχήμα, μέγεθος και λειτουργικότητα προς το αρχικό υπόστρωμα (κερκετίνη), χρησιμοποιήθηκε για την επιλεκτική απομόνωση νέων αναστολέων του HIF-1 από τη ρητίνη του δέντρου Boswellia serrata (λιβάνι), ευρέως χρησιμοποιούμενο αντικαρκινικό φάρμακο στην ελληνική αρχαιότητα και την παραδοσιακή κινέζικη και ινδική ιατρική. Η εφαρμογή εκχυλίσματος της ρητίνης (σε ακετόνη) σε στήλες SPE (πληρωμένες στο εργαστήριο με κλάσμα αποτυπωμένου πολυμερούς 45-90μm) οδήγησε στην ειδική συγκράτηση ενός αριθμού ενώσεων με αποτέλεσμα αποτύπωσης από 5±4 εως 8±4,6 (με αναφορά σε μη αποτυπωμένο πολυμερές, n=3). Το μείγμα των ενώσεων αυτών (μείγμα έκλουσης) ανέστειλλε τη μεταγραφική ενεργότητα του HIF-1, με αναστολή των πρωτεϊνικών επιπέδων του HIF-1α, της ρυθμιστικής υπομονάδας του HIF-1. Αντιθέτως οι ενώσεις που δε συγκρατήθηκαν στη στήλη δεν εμφάνισαν ανασταλτική δράση στο HIF-1. Το ακετυλο-11-κετο-β-μποσβελλικό οξύ (ΑΚΒΑ), ένα από τα κύρια βιοδραστικά συστατικά του λιβανιού, ταυτοποιήθηκε ως ένα από τα κύρια συστατικά του κλάσματος που συγκρατήθηκε ειδικά. Ο προσδιορισμός της βιολογικής δραστικότητας του ΑΚΒΑ, αποκάλυψε ότι αναστέλλει την επαγωγή του HIF-1α και τη μεταγραφική δραστικότητα του HIF-1. Με επακόλουθη ημι-παρασκευαστική χρωματογραφία του μείγματος έκλουσης, το ΑΚΒΑ διαχωρίστηκε χρωματογραφικά από τα υπόλοιπα συστατικά που συγκρατήθηκαν ειδικά. Τα συστατικά αυτά βρέθηκαν επίσης να αναστέλλουν τη μεταγραφική ενεργότητα του HIF-1. Επιπρόσθετα αποτυπώθηκε το ανάλογο του ATP, τρι-Ο-ακετυλοαδενοσίνη, προκειμένου να παραχθεί η προσεγγιστική συνθετική απομίμηση του σημείου πρόσδεσης του ATP στις κινάσες. Η φωσφορυλίωση αποτελεί μία μεταμεταφραστική τροποποίηση η οποία μπορεί να επιφέρει αρνητική ρύθμιση του HIF-1, μέσω αναστολής της δράσης των κατάλληλων κινασών. Βασικό μηχανισμό αναστολής των πρωτεϊνικών κινασών αποτελεί η κατάληψη της περιοχής πρόσδεσης ATP από ενώσεις που παρουσιάζουν δυνατότητα σύνδεσης με τον ίδιο τρόπο (ATP ανταγωνιστές). Η παρασκευή της προσεγγιστικής συνθετικής απομίμησης του σημείου πρόσδεσης του ATP στοχεύει στη δημιουργία ενός πολυμερούς κατάλληλου για σκανάρισμα και απομόνωση νέων ATP μιμητικών αναστολέων πρωτεϊνικών κινασών. Η επιτυχής αποτύπωση της τρι-Ο-ακετυλοαδενοσίνης είχε ως αποτέλεσμα τη σύνθεση πολυμερών με υψηλή συγγένεια προς το αρχικό υπόστρωμα, (Kd ≥ 1,2μΜ), επαρκή αριθμό θέσεων δέσμευσης Ν και σημαντική εξειδίκευση προς το υπόστρωμα (Kd imprinted << Kd control). Συνολικά, η μελέτη αυτή καταδεικνύει το δυναμικό εφαρμογής των MIP για το σκανάρισμα, την αναγνώριση και απομόνωση νέων βιοδραστικών ενώσεων οι οποίες στοχεύουν συγκεκριμένους μοριακούς στόχους, ένα δυναμικό το οποίο ελάχιστα έχει μέχρι σήμερα αποτιμηθεί.