Συμβολή στον χαρακτηρισμό και στη διερεύνηση βιολογικών ιδιοτήτων των στύλων ειδών γένους crocus

Abstract

Among the different species of Crocus only C. sativus has been extensively studied for the composition and the biological properties of its styles. Crocetin is a carotenoid dicarboxylic acid which in nature is esterified with glucose or gentiobiose units forming the crocins abundant components of saffron. In the present study an isocratic reversed phase liquid chromatographic method was developed and validated for the determination of crocetin in plasma. Specificity precision accuracy and stability were also studied with spiked plasma samples and were acceptable. The developed method was applied to the determination of crocetin levels in plasma of four healthy human volunteers before and after consumption of one cup of saffron infusion. Results showed that the concentration of crocetin was high after 2h (1.24-3.67 μΜ) and still determined after 24 h (0.10-0.24). Further studies in constituents of C. sativus styles showed that the antiproliferative effect is mainly attributed to crocetin. Crocetin, also inhibited invasion significantly at the physiological relevant concentrations of 1 and 10 μΜ. Studies in the molecular changes of expression of MMPs and their endogenous inhibitors (TIMPs) were performed following reversed transcription and polymerase chain reaction whereas protein expression and gelatinolytic activity were determined with Western blotting and zymography. The gene and protein expression of MT1-MMP and MT2-MMP were greatly attenuated by both crocetin and all-trans-retinoic acid (ATRA, used as control).

Ανάμεσα στα διάφορα είδη του γένους Crocus ο C. sativus έχει μελετηθεί εκτενώς ως προς τη σύσταση και τις βιολογικές ιδιότητες των στύλων του Η κροκετίνη είναι ένα καροτενοειδές δικαρβοξυλικό οξύ το οποίο στη φύση εστεροποιείται με μονάδες γλυκόζης η γεντιοβιόζης σχηματίζοντας τις κροκίνες (κυρία συστατικά του κρόκου). Στην παρούσα μελέτη ισοκρατική μέθοδος υγρής χρωματογραφίας ανάστροφης φάσης αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε για την ανίχνευση κροκετίνης σε πλάσμα. Η επιλεκτικότητα, η ακρίβεια, η ορθότητα και η σταθερότητα μελετήθηκαν σε εμβολιασμένα δείγματα πλάσματος και ήταν αποδέκτες. Η μέθοδος εφαρμόστηκε στον προσδιορισμό των επιπέδων της κροκετίνης σε πλάσμα τεσσάρων υγιών εθελοντών πριν και μετά την κατανάλωση αφεψήματος κρόκου. Τα αποτελέσματα έδειξαν υψηλή συγκέντρωση της κροκετίνης μετά από 2 ώρες (1.24-3.67 μΜ) και παρουσία της ακόμα και στις 24 ώρες (0.10-0.24). Περαιτέρω μελέτη στις κυτταρικές σειρές MCF-7 και MDA MB-231 έδειξε ανασταλτική δράση των συστατικών στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Όσον αφορά στην επίδραση συστατικών των στύλων του C. sativus η δράση κατά του πολλαπλασιασμού αποδίδεται κυρίως στην κροκετίνη. Η κροκετίνη επίσης ανέστειλε σημαντικά την διήθηση στις φυσιολογικά σχετικές συγκεντρώσεις 1 και 10 μΜ. Μελέτες όσον αφορά στις μοριακές αλλαγές στην έκφραση των MMPs και των ενδογενών τους αναστολέων (ΤΙMPs) έγιναν μετά από αλυσιδωτή αντίδραση πολυμερισμού αντίστροφης μεταγραφάσης ενώ τα επίπεδα πρωτεΐνης καθώς και η ζελατινολυτική δραστικότητα καθορίστηκαν με ανοσοαποτύπωση κατά Western και ζυμογραφήματα. Η γονιδιακή και πρωτεϊνική έκφραση των ΜΤ1-ΜΜΡ και ΜΤ2-ΜΜΡ μειώθηκαν σημαντικά τόσο από την κροκετίνη όσο και από το all trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA χρήση ως τυφλό).