Μελέτη της έκφρασης μορφογενετικής πρωτεΐνης των οστών BMP-4 και του ενδοκυττάριου μεσολαβητή Smad4 σε ακανθοκυτταρικά καρκινώματα του στόματος

Abstract

Malignant neoplasms of the oral cavity are classified in categories C02-C06 of the World Health Organisation International Classification of Diseases (ICD-10). The majority are squamous cell carcinomas. The epidemiological traits of the disease have been changing over the last years. Increasing incidence has been observed in persons younger than 40 years old, who had limited exposure to the common aetiological factors, such as smoking and alcohol consumption. Moreover, the association between oncogenesis and genetic diseases such as anemia Fanconi, or viral infections such as HPV, was elucidated. Epigenetic alterations to the DNA of squamous cells of the oral mucosa were therefore considered as a common parameter of the above mentioned observations. Bone morphogenetic proteins (BMP) are members of the super-family of transforming growth factors-β (TGF-β) and have various effects, mainly intracellularly. Following connention to their receptors, which are located on the target-cell membranes, they activate them and induce phosphorylation and activation of the Smad intracellular messenger molecules. In conclusion, by performing epigenetic adjustments, BMPs affect multiple functions aiming to growth and homeostasis. The association of BMPs and cancer has been investigated for the last twenty years. This research has originated when increased expression of BMP molecules in primary sites of neoplasms with bone metastases was observed. BMPs appear to act both inhibitory and proliferative to tumours, depending on their concentration available to neoplastic cells and the type of tissue. Amongst BMPs, the expression of BMP-4 has been immunohistochemically investigated in tissue samples as well as cell line cultures of various epithelial malignancies. At the same time, intracellular mediator Smad4, which basically transmits the BMP message to the nucleus, is considered as tumour-suppressive. Its expression is cytoplasmatic and nuclear and is decreased in malignant epithelia, in colorectal, oral and pancreatic carcinomas. This decrease occurs in different disease stages for different tissues. According to recent evidence, homozygous depletion of the Smad4 gene for head and neck caused the origin and rapid expansion of malignant neoplasms of the oral cavity in rats.The aim of the present study was 1) to investigate the expression of BMP-4 and Smad4 in oral squamous cell carcinomas and 2) to explore whether this expression is associated to prognosis, as it is estimated bearing in mind histopathological features.Archival materials were obtained from the files of the Pathology Department of Evangelismos General Hospital, Athens, Greece. The study group comprised 51 samples of buccal mucosa, 40 samples of oral tongue squamous cell carcinomas and 21 samples of neck lymph nodes with metastasis (total 112 paraffin blocks). Immunohistochemical investigation was undertaken for all the primary SCC samples, the positive neck specimens and the control group. The latter consisted of eight benign epithelial lesions of the oral mucosa, i.e. one papilloma, three samples of epithelial dysplasia and four samples of epithelial hyperplasia. The control group specimens were obtained from the archives of the Oral Pathology department, Dental School, University of Athens, Greece. BMP-4 was expressed in all the primary and metastatic sites, whereas it appeared weak and inconsistent for the control group. The expression was more extended in tumours with perivascular invasion (p<0,05). In general, the staining was of a higher score for the metastatic compared to the primary sites, but this was not statistically significant. The expression of BMP-4 of the metastatic sites did not seem to be affected by any histological features of the primary sites.Smad4 was absent in 58,6% of the primary and 57,1% of the metastatic sites. However, it was expressed in the mucosa adjacent to the tumour margins, when this was phenotypically free of disease. Moreover, Smad4 was expressed in the control group of benign tumours of the oral mucosa. Between primary sites expressing Smad4, bone invasion was associated with Smad4 expression (p<0,001). Regarding the rest of histological features, the extent of the Smad4 expression in primary sites was associated with a more aggressive histological profile. More precisely, lower keratinization, more nuclear polymorphism, inconsistent pattern of invasion and total A-B score were associated with higher Smad4 expression scores.The expression of BMP-4 and Smad4 in primary sites were associated negatively, i.e. positive BMP-4 stain co-existed with negative Smad4 expression (p<0,001).

Τα κακοήθη νεοπλάσματα της στοματικής κοιλότητας, που κατατάσσονται στις κατηγορίες C02-C06 των νεοπλασιών κατά τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (International Classification of Diseases ICD-10), είναι κατά μεγάλη πλειοψηφία ακανθοκυτταρικά καρκινώματα. Η επιδημιολογία της νόσου άλλαξε τα τελευταία χρόνια, με αυξανόμενη επίπτωση σε άτομα νεότερα των 40 ετών, που δεν είχαν στο ιστορικό τους έκθεση στους συνήθεις αιτιολογικούς παράγοντες, όπως το κάπνισμα και η κατανάλωση αλκοόλ. Επιπρόσθετα, αποκαλύφθηκε η συσχέτιση της ογκογένεσης και με γενετικά νοσήματα, όπως η αναιμία Fanconi ή λοιμώξεις από ιούς. Κοινή παράμετρος αυτών των παρατηρήσεων είναι οι επιγενετικές μεταβολές στο γενετικό υλικό των επιθηλιακών κυττάρων του βλεννογόνου του στόματος. Οι μορφογενετικές πρωτεΐνες οστού (bone morphogenetic proteins, BMP), μέλη της υπερ-οικογένειας των μετασχηματιστικών αυξητικών παραγόντων-β (TGF-β), παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλία δράσεων, οι οποίες επιτελούνται κυρίως ενδοκυττάρια, μετά τη σύνδεσή τους με τους υποδοχείς που φέρουν τα κύτταρα-στόχοι στην κυτταροπλασματική μεμβράνη. Ενδοκυττάρια, οι μεσολαβητές που μεταδίδουν το μήνυμα στον πυρήνα είναι οι πρωτεΐνες Smad, όπως ισχύει για τους περισσότερους TGF. Τελικά, επιτελώντας επιγενετικές ρυθμίσεις, οι BMP επιδρούν σε πολλαπλές λειτουργίες, κατά την αύξηση του οργανισμού και μετά το πέρας αυτής, για ομοιόσταση.Η αιτιολογική σχέση BMP και καρκινωμάτων έχει ξεκινήσει να διερευνάται την τελευταία εικοσαετία, με αφορμή την αυξημένη έκφραση των μορίων αυτών στα παρασκευάσματα πρωτοπαθών όγκων από ασθενείς με οστικές μεταστάσεις. Οι κυτοκίνες αυτές φαίνεται να δρουν τόσο ογκοκατασταλτικά όσο και ογκοπροαγωγικά, ανάλογα με το είδος του ιστού και τη συγκέντρωσή τους στο κυτταρικό μικροπεριβάλλον. Μεταξύ των κυτοκινών BMP, η έκφραση της BMP-4 έχει διερευνηθεί σε ιστοτεμάχια και κυτταρικές σειρές από όγκους επιθηλιακής προέλευσης, με ανοσοϊστοχημικές μελέτες και έχει φανεί πως αυξάνεται σε σχέση με το φυσιολογικό επιθήλιο. Παράλληλα, ο ενδοκυττάριος μεσολαβητής Smad4, που στην ουσία μεταφέρει στον πυρήνα το μήνυμα των BMP, θεωρείται ογκοκατασταλτικός παράγοντας. Έχει παρατηρηθεί ότι η έκφρασή του είναι μειωμένη στο καρκινικό επιθήλιο, σε καρκίνο παχέος εντέρου, παγκρέατος και στόματος, ενώ το στάδιο της νόσου στο οποίο συμβαίνει αυτό (πρώιμο ή όψιμο) εξαρτάται και από το είδος του επιθηλίου.Σκοπός της μελέτης ήταν, να χαρτογραφηθεί η έκφραση BMP-4 και Smad4 σε ακανθοκυτταρικά καρκινώματα στοματικής κοιλότητας και να διερευνηθεί κατά πόσο αυτή η έκφραση σχετίζεται με την πρόγνωση, όπως η τελευταία εκτιμάται από την ιστολογική εικόνα. Το υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 112 εγκυβωτισμένα ιστοτεμάχια από το αρχείο του Παθολογοανατομικού Τμήματος του ΓΝΑ «ο Ευαγγελισμός», για τα έτη 2005-10. Η ανοσοϊστοχημεία έγινε με τη μέθοδο στρεπταβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης και χρησιμοποιήθηκαν τα εξής αντισώματα: 1) πολυκλωνικό αντίσωμα BMP-4 (Lifespan sciences) και 2) μονοκλωνικό αντίσωμα Smad4 (Santa-Cruz Biotechnology). Η έκφραση BMP-4 ήταν θετική στο σύνολο των πρωτοπαθών και των μεταστατικών εστιών, ενώ ήταν αδύναμη και ανακόλουθη στους μάρτυρες με καλοήθεις βλάβες. Η έκφραση BMP-4 ήταν μεγαλύτερης έκτασης στους όγκους με περιαγγειακή διήθηση, σε στατιστικά σημαντικό επίπεδο. Η ανοσοέκφραση στις λεμφαδενικές μεταστάσεις ήταν γενικά μεγαλύτερης έκτασης από των πρωτοπαθών εστιών, αλλά αυτή η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Επιπρόσθετα, η έκφραση BMP-4 στους θετικούς λεμφαδένες δε φάνηκε να επηρεάζεται από τους ιστολογικούς χαρακτήρες των πρωτοπαθών εστιών.Η έκφραση Smad4 ήταν συχνότερα αρνητική τόσο για τις πρωτοπαθείς εστίες, όσο και για τους θετικούς λεμφαδένες. Αντίθετα, το Smad4 είχε θετική έκφραση στα όρια των όγκων που ήταν ελεύθερα νόσου μικροσκοπικά, αλλά και στις καλοήθεις επιθηλιακές βλάβες που χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Οι καρκινικές βλάβες με θετική έκφραση Smad4 παρουσίαζαν συχνότερα οστική διήθηση, και πιο επιθετική ιστολογική εικόνα, με υψηλή συνολική βαθμολογία Anneroth-Bryne, χαμηλή κερατινοποίηση, αυξημένο βαθμό πυρηνικής πλειομορφίας και πιο επιθετικό πρότυπο διήθησης. Η έκφραση Smad4 στους θετικούς λεμφαδένες δε φάνηκε να επηρεάζεται από τα ιστολογικά χαρακτηριστικά των πρωτοπαθών εστιών και δε διέφερε από την έκφραση στις πρωτοπαθείς εστίες.Σε σχέση με την έκφραση BMP-4 και Smad4 στις πρωτοπαθείς εστίες, φάνηκε από την παρούσα μελέτη να συσχετίζονται αρνητικά, δηλαδή η θετική έκφραση BMP-4 συνυπήρχε με απουσία Smad4, σε στατιστικά σημαντικό επίπεδο.