Study of anti-inflammatory functions of HDL in experimental mouse models

Abstract

HDL has important immunomodulatory properties, including the attenuation of lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory response. Τhe purpose of this study was to investigate the potential correlation between HDL shape and composition and its anti-inflammatory functions and properties in LPS-induced inflammation. As lecithin-cholesterol acyltransferase (LCAT) is a critical enzyme in the maturation of HDL we investigated whether LCAT-deficient (Lcat-/-) mice that lack mature HDL present an increased LPS-induced inflammatory response. The effects in Lcat-/- mice were compared to Apolipoprotein A-I-deficient (Apoa1-/-) mice, which lack classical HDL and are known to have an increased response to LPS, and control wild-type (WT) mice. Characterization of apolipoprotein composition of HDL, revealed that LCAT-deficient HDL is primarily composed of ApoE, while HDL from Apoa1-/- mice is highly enriched in ApoE and ApoA-II. Further analyses, showed clear differences in the lipid composition of HDL among the three groups. As expected based on the structural data of HDL, LPS (100 µg/kg body weight)-induced cytokine response in both Lcat-/- and Apoa1-/- mice was markedly enhanced and prolonged compared to WT mice. Ex vivo stimulation of whole blood with LPS (1-100 ng/mL) showed a similar enhanced pro-inflammatory phenotype. Further characterization in RAW 264.7 macrophages in vitro showed that serum and HDL, but not chylomicrons and VLDL (triglyceride-rich lipoproteins; TRL fraction) or the lipid-free protein fraction of Lcat-/- mice, had a reduced capacity to attenuate the LPS-induced TNFα response. ApoA-Ι-deficiency did not affect the capacity of HDL to neutralize LPS. Additional immunophenotyping showed that Lcat-/-, but not Apoa1-/- mice, have markedly increased circulating monocyte numbers as a result of an increase in ‘mildly pro-inflammatory’ Cd11b+LyCmid monocytes, whereas ‘highly pro-inflammatory’ Cd11b+LyChi monocytes were reduced. In line with this observation, Kuppfer cells in the Lcat-/- liver had a rather anti-inflammatory, regulatory phenotype, while peritoneal macrophages of Lcat-/- mice also showed a markedly dampened LPS-induced TNFα response. However, fluorescent microscopy studies of membrane cholesterol content and fluidity, were not able to provide a correlation between membrane cholesterol and rigidity, and macrophage responsiveness to LPS. Importantly, reintroducing LCAT by adenovirus-mediated gene transfer (AdLCAT) to Lcat-/- mice reverted their lipid profile and Ly6Chi/Ly6Cmid monocyte ratio back to that of WT mice. Consequently, AdLCAT-treated Lcat-/- mice, presented significant decrease in TNFα levels when stimulated with LPS, compared to the Lcat-/- group treated with the control adenovirus AdGFP. Based on the above, we conclude that LCAT-deficiency increases LPS-induced inflammation in mice due to reduced LPS-neutralizing capacity of immature discoidal HDL, as well as increased monocyte number despite the disturbed monocyte/macrophage phenotype.

H υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (HDL) έχει σημαντικές ανοσορυθμιστικές ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένης της εξασθένησης της φλεγμονώδους απόκρισης που επάγεται από τον λιποπολυσακχαρίτη (LPS). Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει την πιθανή συσχέτιση μεταξύ της δομής και της σύνθεσης της HDL και των αντι-φλεγμονωδών λειτουργίων της στην LPS-επαγόμενη φλεγμονή. Καθώς η λεκίθινο-χοληστερολική ακυλοτρανσφεράση (LCAT) είναι ένα κρίσιμο ένζυμο στην ωρίμανση της HDL ερευνήσαμε αν τα ποντίκια με ανεπάρκεια στο ένζυμο LCAT (Lcat-/-) που στερούνται ώριμης σφαιρικής HDL, παρουσιάζουν αυξημένη LPS-επαγόμενη φλεγμονώδη απόκριση. Η επίδραση του LPS στα Lcat-/-ποντίκια συγκρίθηκε με αυτή των ποντικιών με ανεπάρκεια στην απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (Αροa1-/-) ποντίκια, τα οποία στερούνται κλασικής HDL και είναι γνωστό ότι έχουν αυξημένη απόκριση στο LPS, και με άγριου τύπου (WT) ποντίκια ελέγχου. Ο χαρακτηρισμός της απολιποπρωτεΐνικής σύνθεσης της HDL, αποκάλυψε ότι η HDL των Lcat-/- ποντικιών αποτελείται κατά κύριο λόγο από ΑροΕ, ενώ η HDL των Αροa1-/- ποντικιών είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένη σε ΑροΕ και ΑροΑ-ΙΙ. Περαιτέρω αναλύσεις έδειξαν σαφείς διαφορές στη σύνθεση των λιπιδίων της HDL μεταξύ των τριών ομάδων. Όπως αναμενόταν, η LPS-επαγόμενη (100 μg / kg βάρους σώματος) απόκριση κυτταροκινών τόσο των Lcat-/- όσο και των Αροa1-/- ποντικιών ήταν σημαντικά ενισχυμένη και παρατεταμένη σε σύγκριση με τα WT ποντίκια. Διέγερση ολικού αίματος με LPS (1-100 ng /mL) ex vivo έδειξε εναν παρόμοια ενισχυμένο προ-φλεγμονώδη φαινότυπο. Περαιτέρω χαρακτηρισμός σε RAW 264.7 μακροφάγα in vitro έδειξε ότι ο ορός και η HDL, αλλά όχι τα χυλομικρά και τα VLDL (πλούσιες σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεΐνες - κλάσμα TRL) ή το κλάσμα απολιπιδιωμένων πρωτεΐνών των Lcat-/- ποντικιών, είχαν μειωμένη εξουδετερωτική ικανότητα της LPS-επαγόμενης απόκρισης του TNFα. Αντίθετα, η ανεπάρκεια για την ΑροΑ-Ι δεν επηρέασε την ικανότητα της HDL να εξουδετερωσει το LPS. Πρόσθετες μελέτες ανοσοφαινότυπησης έδειξαν ότι μόνο τα Lcat-/- και όχι τα Αροa1-/- ποντίκια, έχουν σημαντικά αυξημένους αριθμούς κυκλοφορούντων μονοκυττάρων, ως αποτέλεσμα της αύξησης των «ήπια προ-φλεγμονωδών» CD11b+LyCmid μονοκύτταρων, κι όχι λόγω των «έντονα προ-φλεγμονωδών» CD11b+LyChi μονοκύτταρων τα οποία παρουσίασαν αν μη τι αλλο μείωση. Σύμφωνα με αυτή την παρατήρηση, τα κύτταρα Kuppfer στο ήπαρ των Lcat-/- ποντικιών φαίνεται να έχουν έναν αντι-φλεγμονώδη, ρυθμιστικό φαινότυπο, ενώ τα περιτοναϊκά μακροφάγα των Lcat-/- έδειξαν επίσης μια αξιοσημείωτα μειωμένη LPS-επαγόμενη απόκριση του TNFα. Ωστόσο, μελέτες φθορίζουσας μικροσκοπίας έδειξαν οτι η περιεκτικότητα της μεμβράνης σε χοληστερόλη και η ρευστότητα της, δεν ήταν σε θέση να παράσχουν μία συσχέτιση μεταξύ αυτών των παραμέτρων, και της ανταπόκρισης των μακροφάγων στο LPS. Είναι σημαντικό ότι η επανεισαγωγή του ενζύμου LCAT με τη χρήση αδενοϊού (AdLCAT) στα Lcat-/- ποντίκια, επανέφερε το προφίλ λιπιδίων και την αναλογία Ly6Chi/Ly6Cmid των μονοκυττάρων στα επίπεδα των WT ποντικιών. Κατά συνέπεια, τα Lcat-/- ποντίκια στα οποία χορηγήθηκε ο αδενοϊος AdLCAT, παρουσίασαν σημαντική μείωση στα επίπεδα του TNFα μετά τη μόλυνση με LPS, σε σύγκριση με τα Lcat-/- ποντίκια που έλαβαν τον αδενοϊό ελέγχου AdGFP. Με βάση τα παραπάνω, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η ανεπάρκεια του ενζύμου LCAT στα ποντίκια, προκαλεί αύξηση της LPS-επαγόμενης φλεγμονής γεγονός που οφείλεται στη μειωμένη ικανότητα εξουδετέρωσης του LPS από την ανώριμη δισκοειδή HDL, καθώς και στον αυξημένο αριθμό των μονοκυττάρων, παρά τον διαταραγμένο φαινότυπο μονοκυττάρων/μακροφάγων.