Μελέτη του μηχανισμού ενεργοποίησης του παράγοντα που επάγεται από την υποξία HIF-1a in vitro και σε πρωτογενείς καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων αεραγωγών

Abstract

The present study deals with the investigation of the molecular mechanisms involved in the regulation and activation of the hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α). At first, we examined the induction mechanisms of HIF-1α in primary cultures of airway smooth muscle (ASM) cells. The use of specific inhibitors revealed that ΗΙF- 1α, in ASM cells that are cultured in the absence of fetal bovine serum and thus obtain their “differentiated” contractile apparatus, is induced by two distinct mechanisms. The first mechanism that is induced by cobalt is the stabilization of the protein due to a possible inhibition of prolyl-hydroxylases and the second one that is induced by serum, involves enhanced synthesis of HIF-1α through transcription, translation and involvement of the PI-3K pathway. On the contrary, cobalt induces HIF-1α mainly through his protein synthesis, in “synthetic” ASM cells, that are cultured in the presence of serum, by using the activated PI-3K pathway. In order to further study the molecular properties of HIF-1α in vitro we used recombinant full length HIF-1α that was produced for the first time in bacteria. This unmodified form of HIF-1α was able to form a stable heterodimer with the second subunit of HIF-1 (ARNT) when both proteins were co-expressed in E. coli. The reconstituted heterodimer exhibited specific DNA binding activity. The amino-terminal regions of the two subunits were bound to DNA but this activity was affected by the carboxy-terminal regions of the two proteins. Furthermore, during the study of interaction of recombinant HIF-1α with p42-MAPK, the exact phosphorylation positions of HIF-1α were revealed. Finally, we studied the unknown nuclear transport mechanism of HIF-1α and we showed that importins 4 and 7 are responsible for HIF-1α import and thus define two distinct import pathways for the protein.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν οι μοριακοί μηχανισμοί ρύθμισης και ενεργοποίησης του παράγοντα που επάγεται από την υποξία ΗΙF-1α. Αρχικά διερευνήθηκε ο μηχανισμός επαγωγής του HIF-1α σε λεία μυϊκά κύτταρα αεραγωγών (ΛΜΚΑ). Η χρήση αναστολέων κυτταρικών μονοπατιών αποκάλυψε πως η επαγωγή του HIF-1α σε ΛΜΚΑ που καλλιεργούνται απουσία ορού και παρουσιάζουν τον επιμήκη «διαφοροποιημένο» φαινότυπο μπορεί να επιτευχθεί μέσω δύο τουλάχιστον μηχανισμών. Ο πρώτος μηχανισμός που ενεργοποιείται από το κοβάλτιο οδηγεί στη σταθεροποίηση του HIF-1α πιθανά μέσω αναστολής των πρόλυλο-υδροξυλασών ενώ ο δεύτερος που ενεργοποιείται από τον ορό ενέχει την αύξηση της σύνθεσης του μέσω μεταγραφής και μετάφρασης ενώ φαίνεται να εμπλέκει και το μονοπάτι της PI-3K. Αντίθετα σε «συνθετικά» ΛΜΚΑ που καλλιεργούνται συνεχώς παρουσία ορού το κοβάλτιο επάγει τον HIF-1α κυρίως μέσω αύξησης της μετάφρασης του mRNA του χρησιμοποιώντας το μονοπάτι της PI-3K που είναι ήδη ενεργοποιημένο από τον ορό. Για να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός ενεργοποίησης του HIF-1α in vitro χρησιμοποιήθηκε ανασυνδυασμένος HIF-1α πλήρους μεγέθους που παράχθηκε για πρώτη φορά, σε βακτήρια. Δείχθηκε πως ο ανασυνδυασμένος HIF-1α έχει τη δυνατότητα να συνδέεται σταθερά με τον συμπαράγοντα του ARNT μόνο όταν οι δυο πρωτεΐνες συνεκφραστούν στα ίδια E.coli κύτταρα. Επιπλέον, το σύμπλοκο που προκύπτει είναι ικανό για ειδική σύνδεση σε αλληλουχία του DNA που περιέχει τα στοιχεία απόκρισης στην υποξία (HRE). H σύνδεση γίνεται μέσω των αμινοτελικών άκρων των δύο υπομονάδων αλλά επηρεάζεται και από τα καρβοξυτελικά άκρα τους. Ο μη τροποποιημένος ανασυνδυασμένος HIF-1α χρησιμοποιήθηκε επίσης στη μελέτη της φωσφορυλίωσης του από την p42 MAP κινάση. Με αυτόν τον τρόπο αποκαλύφθηκαν για πρώτη φορά οι ακριβείς θέσεις φωσφορυλίωσης του από τη συγκεκριμένη κινάση. Τέλος μελετήθηκε ο άγνωστος μέχρι στιγμής μηχανισμός μεταφοράς του HIF-1α στον πυρήνα και δείχθηκε ότι οι ιμπορτίνες 4 και 7 είναι υπεύθυνες για την είσοδο του στον πυρήνα υποδεικνύοντας έτσι την ύπαρξη δύο διαφορετικών μονοπατιών εισόδου.