Βιοσύνθεση και ρύθμιση μεταβολισμού των γλυκοσινολικών οξέων στο φυτό Eruca sativa

Abstract

Rocket (Eruca sativa) is a salad vegetable classified in Brassicaceae family. It derives its origin from the Mediterranean region but it is widely used in human diet all over the world. It is rich in glucosinolates, amino acid-derived compounds belonging to the general category of plant secondary metabolites. Glucosinolates can be found mainly in the order Caparrales and especially in the Brassicaceae family. Being rich in nitrogen and sulfur, their molecule consists of a thioglucose unit (the core), a sulfonated oxime unit, and a variable side chain. Their division in three major groups (aliphatic, aromatic and indolyl glucosinolates) depends on the amino acid they derive from, which may be methionine, phenylalanine and tryptophan respectively. As intact molecules, glucosinolates are inactive and have no known function, but after cell disruption they react with a thioglucosidase known as myrosinase, and hydrolyse into various other metabolites (isothiocyanates, nitriles, thiocyanates, epithionitriles and oxazolidine-2-thiones). These products are bioactive and have some interesting properties, ranging from antimicrobial and cancer-preventing to inflammatory activities.Their biosynthetic pathway has been studied in Arabidopsis thaliana, which also belongs to the Brassicaceae family. The procedure begins with a precursor amino acid, which can be one of the three mentioned above, and contains three stages: (i) side-chain elongation of amino acids, (ii) development of the core structure, and (iii) secondary side-chain modifications. Most of the enzymes and genes involved are known in A.thaliana and comparative genomics studies have also been performed. As a result, a lot of sequences of glucosinolate pathway genes from other Brassicaceae plants hane been identified and can be obtained from databases such as GenBank. Neither the genome of Eruca sativa nor the sequences of genes participating in glucosinolate biosynthesis are known. The aim of this study is to make a start in understanding the biosynthetic process of glucosinolates in Eruca sativa. Sequences related with biosynthetic genes and transcriptional factors were isolated. The influence of N and S fertilization in the biosynthetic genes expression was also examined. CDSs of glucosinolate biosynthesis and regulatory genes obtained from NCBI database were used to design specific and degenerated primers in order to amplify one part of the sequence of each gene we were interesting in. Primers were designed based on conserved areas of genes of other Brassicaceae plants such as Arabidopsis thaliana and Brassica rapa. A total of 15 genes were isolated, containing a full-length (12 of them) or a partial (3 of them) coding sequence. All genes are highly related with glucosinolate biosynthetic and regulator genes of Arabidopsis thaliana and they share a similarity ranging from 82 – 90 %. When they are compared to orthologs of other Brassica species such as Brassica rapa similarity is higher and ranges from 85 to 95 %. Three of the full-length genes were cloned in expression vectors in order to isolate the corresponding protein.It was also interesting to find whether the expression levels of each gene are decreased or increased when plants grow in different nitrogen and sulfur nutrition conditions. Two experimental approaches were designed. Plants of the first experimental approach were separated into 4 groups-treatments, grown in a different nutrient solution each. The first group consisted of plants grown in full strength Hoagland nutrient solution, whereas plants of the other groups were watered with modified Hoagland nutrient solutions; low nitrogen for the second, low nitrogen and sulfur for the third and low sulfur for the fourth group. In the second approach, the condition of a short-term sulfur starvation was investigated. Tissues from leaves and roots were harvested for total RNA extraction and cDNA synthesis. Relative expression of genes was studied by real-time PCR. The applied nutritional conditions affected the expression of the biosynthetic genes in both experimental approaches. It is also known that the concentration of the glucosinolates is affected by such conditions as well. Transcriptional and metabolic profiles from each treatment were statistically analyzed in order to find if they are correlated and in most cases there was a correlation between them. Extracts from the tissues of the plants growing in different nutrition conditions were tested towards the growth of HeLa, MCF7 and HepG2 cancer cell lines, in order to study their biological activity. Differention in their biological activity was noted, depending on the fertilization levels.

Το φυτό Eruca sativa (ρόκα) αποτελεί μέλος της οικογένειας των Brassicaceae, που μεταξύ άλλων έχουν ως χαρακτηριστικό την παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών που ονομάζονται γλυκοσινολικά οξέα (glucosinolates) (ΓΚΣ). Οι ενώσεις αυτές έχουν ενδιαφέρουσες ιδιότητες που εκτείνονται από την άμυνα των φυτών έναντι διαφόρων εχθρών και παθογόνων μικροοργανισμών, μέχρι τη χημειοπροφύλαξη στον άνθρωπο. Το μονοπάτι της βιοσύνθεσής τους είναι γνωστό στο φυτό-μοντέλο Arabidopsis thaliana, το οποίο ανήκει στην παραπάνω οικογένεια. Η πλειοψηφία των αλληλουχιών των γονιδίων που συμμετέχουν έχει αποκαλυφθεί, όπως επίσης και ο ρόλος τους. Στην παρούσα διατριβή απομονώθηκαν αλληλουχίες γονιδίων που συμμετέχουν στη βιοσύνθεση των ΓΚΣ στο φυτό Eruca sativa. Αυτό κατέστη δυνατό με in silico διερεύνηση των διαθέσιμων αλληλουχιών από άλλα φυτά της ίδιας οικογένειας με σκοπό το σχεδιασμό κατάλληλων εκκινητών και τη χρήση τους σε αντίδραση PCR. Η τεχνική 5’/3’ RACE ολοκλήρωσε το αποτέλεσμα και έτσι εν τέλει απομονώθηκαν 15 αλληλουχίες, 12 από αυτές πλήρους μήκους (full-length) που σχετίζονται με βιοσυνθετικά γονίδια και μεταγραφικούς παράγοντες της βιοσύνθεσης των γλυκοσινολικών οξέων. Στη συνέχεια έγινε κατασκευή φυλογενετικών δέντρων στα οποία χρησιμοποιήθηε η πρωτεϊνική ακολουθία, όπου οι απομονωθείσες αλληλουχίες συγκρίνονται με άλλες που ανήκουν στην ίδια οικογένεια γονιδίων. Τρεις από τις αλληλουχίες πλήρους μήκους κλωνοποιήθηκαν σε φορείς έκφρασης με σκοπό την απομόνωση της πρωτεΐνης που προκύπτει. Παρατηρήθηκε μεγάλη ομοιότητα νουκλεοτιδικής αλληλουχίας μεταξύ των γονιδίων που απομονώθηκαν και των αντιστίχων τους από άλλα φυτά με τα οποία συγκρίθηκαν. Οι ομοιότητες φτάνουν ακόμα και το 95%, ενώ σε όλες τις περιπτώσεις το ποσοστό είναι πάνω από 85%, ενισχύοντας την υπόθεση για την ταυτότητα των γονιδίων που απομονώθηκαν. Ενδιαφέρον είναι ότι τα ποσοστά ομοιότητας είναι πάντα μεγαλύτερα όταν οι αλληλουχίες με τις οποίες γίνεται η σύγκριση προέρχονται από φυτά του γένους Brassica. Επίσης, από τα φυλογενετικά δέντρα που κατασκευάστηκαν φαίνεται η ομαδοποίηση των γονιδίων μαζί με τα υπόλοιπα της ίδιας οικογένειας στην οποία κατά περίπτωση ανήκουν. Τέλος, η υπερέκφραση των γονιδίων και η απομόνωση της αντίστοιχης πρωτεΐνης δείχνει τη λειτουργικότητα των γονιδίων που απομονώθηκαν. Για τη μελέτη της έκφρασης των γονιδίων που συμμετέχουν στη βιοσύνθεση των ΓΚΣ σχεδιάστηκαν δύο πειραματικές προσεγγίσεις που αφορούν στη χορήγηση αζώτου και θείου (βασικά δομικά στοιχεία των ΓΚΣ) στα φυτά. Στην πρώτη στόχος ήταν να εξεταστεί η περίπτωση που α)το άζωτο, β)το θείο και γ)και τα δυο μαζί είναι μειωμένα καθ’όλη τη διάρκεια ανάπτυξης των φυτών. Στη δεύτερη μελετήθηκε η περίπτωση της συνθήκης μειωμένου θείου μόνο κατά τις πρώτες μέρες της ανάπτυξης των φυτών. Συλλέχθηκαν ιστοί φύλλων και ρίζας από όλες τις περιπτώσεις για εξαγωγή ολικού RNA και κατασκευή cDNA αλυσίδας και μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων με PCR πραγματικού χρόνου (real-time). Οι συνθήκες που εφαρμόστηκαν έδειξαν να επηρεάζουν σημαντικά το μεταγραφικό προφίλ. Στις περισσότερες περιπτώσεις αυτό έδειξε συσχετισμό με αντίστοιχα δεδομένα μεταβολικού προφίλ. Εκχυλίσματα από τους ιστούς των φυτών που αναπτύχθηκαν υπό διαφορετικά επίπεδα λίπανσης δοκιμάστηκαν ως προς τη βιολογική τους δράση στην ανάπτυξη καρκινικών κύτταρων των σειρών HeLa, MCF7 και HepG2. Τα περισσότερα εκχυλίσματα παρουσίασαν αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και καταγράφηκε διαφοροποίηση της βιολογικής δράσης των εκχυλισμάτων ανάλογα με τα επίπεδα λίπανσης. Επιπλέον, έγινε κλασμάτωση των εκχυλισμάτων με σκοπό τον εμπλουτισμό τους σε γλυκοσινολικά οξέα και εκ νέου επώαση με κύτταρα των προαναφερθέντων κυτταρικών σειρών. Στις περισσότερες περιπτώσεις τα εκχυλίσματα διατήρησαν ή αύξησαν την ικανότητα αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης.