Μελέτη της ανάπτυξης του τραχειακού συστήματος της Drosophila melanogaster

Abstract

Epithelia are key building blocks of many organs. They play important structural and functional roles, such as the establishment of permeability barriers. The insect respiratory system is a vital organ consisting of a tubular network that delivers oxygen to all organs. It develops during embryogenesis and becomes functional just before larval hatching. The system has long been studied as a tractable model to understand the development and function of epithelial tubular organs. A genetic screen had been conducted to identify new candidate genes involved in the development of the fly respiratory system. This screen led to the identification of Btk29A as essential for spiracle morphogenesis and tracheal barrier function. Btk29A encodes for a Tec tyrosine kinase, conserved across vertebrates and invertebrates. The aim of this study was to unravel the role of Btk29A in Drosophila respiratory system. Analysis showed that Btk29A is expressed in the trachea and posterior spiracles. Drosophila posterior spiracles connect the trachea to the environment. They consist of the spiracular chamber and the stigmatophore. Both spiracular compartments express Btk29A. Btk29A mutants display shorter spiracles with abnormal shape. In vivo imaging of posterior spiracles in Btk29A mutants revealed that the invagination is incomplete with the most distal cells failing to invaginate. Parameters known to affect spiracular invagination were examined: apical constriction, cell shape changes, actomyosin organization and activation of Rho1GTPase. None of these parameters seems impaired in Btk29A mutants. Additionally, phenotypic rescue experiments, using the UAS-GAL4 system, showed that recovery of Btk29A by the spiracular chamber cells does not rescue the invagination phenotype, while recovery of the kinase in the stigmatophore leads to normally shaped spiracles. These observations suggest that Btk29A regulates spiracular chamber invagination through regulation of stigmatophore morphogenesis. In vivo imaging showed that Btk29A is indeed important for the regulation of the spatial rearrangements of the stigmatophore cells. The positioning of the spiracular chamber cells and the execution of their invagination is highly dependent on stigmatophore cell rearrangements. Overall, it seems that Btk29A affects spiracle morphogenesis in two ways: it cell-autonomously controls the convergent extension of stigmatophore cells and ensures, non-cell autonomously, the efficient invagination of spiracular chamber cells. The respiratory system of Btk29A mutants is characterised by leaky tracheal permeability barrier. The trachea morphology is not affected. Examination of the Septate Junctions (SJs), which are crucial for the establishment of epithelial permeability barriers in Drosophila, showed that the ultrastructure of the tracheal SJs and the subcellular localization of the SJ proteins, are not impaired in Btk29A mutants. Thus, the permeability phenotype is likely not due to gross impairment in SJ formation or maintenance. This work offers insights into the role of Btk29A in the Drosophila respiratory system and highlights the complex physical interactions that take place among organ components during morphogenesis.

Τα επιθήλια αποτελούν δομικές και λειτουργικές μονάδες πολυάριθμων ιστών. Εμπλέκονται σε φυσιολογικές διεργασίες και προστατεύουν τον οργανισμό από την εισβολή παθογόνων, λειτουργώντας ως φραγμοί διαπερατότητας. Το αναπνευστικό σύστημα των εντόμων αποτελείται από δίκτυο επιθηλιακών αγωγών που μεταφέρουν οξυγόνο στα επιμέρους όργανα. Για τον εντοπισμό νέων γονιδίων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του αναπνευστικού συστήματος της Drosophila και ειδικότερα στο σχηματισμό του τραχειακού φραγμού διαπερατότητας, πραγματοποιήθηκε γενετική διαλογή μεταλλαγμένων στελεχών. Ταυτοποιήθηκε το γονίδιο Btk29A ως σημαντικό για τη μορφογένεση των ΟΑΣ, και τη λειτουργία του τραχειακού φραγμού διαπερατότητας. Το Btk29A κωδικοποιεί για μια Tec κινάση τυροσίνης, συντηρημένη στα σπονδυλωτά και στα ασπόνδυλα. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η αποσαφήνιση του ρόλου του Btk29A στο αναπνευστικό σύστημα της Drosophila. Ανάλυση της έκφρασης του Btk29A αποκάλυψε πως εκφράζεται στα κύτταρα της τραχείας και των ΟΑΣ. Τα ΟΑΣ συνδέουν την τραχεία με το περιβάλλον. Αποτελούνται από τον αναπνευστικό θάλαμο και το στιγματοφόρο. Τα κύτταρα των δυο επιμέρους τμημάτων εκφράζουν Btk29A. Σε Btk29A μεταλλαγμένα έμβρυα, τα ΟΑΣ είναι κοντύτερα από αυτά των αγρίου τύπου εμβρύων και εμφανίζουν μη φυσιολογικό σχήμα. Παρατήρηση των ΟΑΣ με in vivo μικροσκοπία, αποκάλυψε πως τα κύτταρα του αναπνευστικού θαλάμου δεν ολοκληρώνουν την εγκόλπωση που είναι αναγκαία για τη μορφογένεσή τους, με τα πιο οπίσθια κύτταρα να παραμένουν στην επιφάνεια. Για καλύτερη ανάλυση του φαινοτύπου, εξετάσθηκαν παράμετροι που εμπλέκονται στην εγκόλπωση των συγκεκριμένων κυττάρων: σύσφιξη της κορυφαίας μεμβράνης, κυτταρικό σχήμα, οργάνωση του κυτταροσκελετού και ενεργότητα της Rho1GTPase. Καμία από τις παραπάνω παραμέτρους δεν επηρεάζεται σε Btk29A μεταλλαγμένα έμβρυα. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα διάσωσης φαινοτύπου βασισμένα στην ιστοειδική έκφραση του Btk29A μέσω του συστήματος UAS-GAL4. Επαναφορά της έκφρασης της Btk29A στα κύτταρα του αναπνευστικού θαλάμου δε διασώζει την ανώμαλη μορφογένεση των ΟΑΣ. Ο φαινότυπος διασώζεται με επαναφορά της Btk29A στα κύτταρα του στιγματοφόρου. Συνεπώς, η εγκόλπωση των κυττάρων του αναπνευστικού θαλάμου είναι πιθανό να ρυθμίζεται κυτταρικά μη αυτόνομα μέσω δράσης της Btk29A στα κύτταρα του στιγματοφόρου. Παρατήρηση του στιγματοφόρου με in vivo μικροσκοπία, αποκάλυψε πως η Btk29A είναι σημαντική για τις ανακατατάξεις των κυττάρων αυτών. Η σωστή ρύθμιση των ανακατατάξεων συμβάλει στη φυσιολογική τοποθέτηση των κυττάρων του αναπνευστικού θαλάμου και την ολοκλήρωση της εγκόλπωσης τους. Το αναπνευστικό σύστημα των Btk29A μεταλλαγμένων στελεχών χαρακτηρίζεται και από διατάραξη του τραχειακού φραγμού διαπερατότητας. Η μορφολογία της τραχείας δεν επηρεάζεται. Εξετάσθηκε η δομή και η μοριακή σύσταση των Διαφραγματικών Συνδέσεων (ΔΣ), που είναι σημαντικές για το σχηματισμό και τη διατήρηση των επιθηλιακών φραγμών διαπερατότητας. Ανάλυση των ΔΣ της τραχείας δεν αποκάλυψε ανωμαλία στη δομή και τον εντοπισμό των πρωτεϊνών που τις συνιστούν. Συνεπώς, η διατάραξη του φραγμού διαπερατότητας δεν είναι αποτέλεσμα διατάραξης των ΔΣ. Η παρούσα μελέτη προσφέρει νέες πληροφορίες για τη δράση της Btk29A στο αναπνευστικό σύστημα της Drosophila και επισημαίνει τη σημασία των αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσονται μεταξύ των οργάνων για τη σωστή ανάπτυξη και λειτουργία τους.