Μελέτη του συμπλόκου αποικοδόμησης της β-κατενίνης σε σποραδικά και κληρονομικά διηθητικά καρκινώματα μαστού

Abstract

Breast cancer is the most common malignancy occurring in women. So far, despite the progress made in identifying and treating breast cancer, mortality remains high. Today, research focuses on finding molecular prognostic markers that will contribute to better treatment of these patients. Among the biomarkers studied, are those associated with signal transduction pathways. These pathways are associated with survival, proliferation and migration of cancer cells. The signaling pathway Wnt / beta-catenin has been considered as a central regulator of the translation of proteins involved in controlling proliferation, growth, migration and survival of cancer cells and thus participates in the carcinogenesis and progression of breast cancer.Wnt proteins constitute a large family of glycoproteins that bind to Frizzled receptors. The Wnt signaling pathway regulates at least three different cascades, but the best studied is that of beta-catenin. It has been shown that abnormalities of this pathway lead to various human diseases, such as the formation of tumors and genetic bone disorders.According to the generally accepted model for this pathway, when Wnt is not active in cells, a complex consisting of the proteins CKIa (casein kinase Ia), GSK-3β (glycogen synthase kinase-3β), APC (adenomatous polyposis coli) and Axin is formed. This complex phosphorylates beta-catenin which is subsequently degraded in the cytoplasm.The existence of mutations in exon 3 of beta-catenin gene is associated with an aggressive phenotype in some cancer types such as prostate, endometrial and hepatocellular carcinomas. In breast cancer, however, mutations in exon 3 of the gene of beta-catenin are rare or absent.The aim of this study was to investigate the expression pattern of the proteins participating in the destruction complex of beta-catenin AXIN, and GSK-3β in 232 invasive breast carcinomas (154 sporadic and 78 familial) and the existence of mutations in exons 1 and 2 of the beta-catenin gene in 124 cases. The results of these markers were statistically analyzed in order to investigate their association with a) Classical clinicopathological parameters (age, menopausal status, tumor size, histological type, histological and nuclear grade, stage and hormone receptors), b) Overall and disease-free patients’ survival, c) Novel biological markers. Based on the correlations obtained we estimate the possible involvement of these proteins, and mutations of beta-catenin gene, in aggressiveness and prognosis of breast cancer.Our material consisted pf 232 primary invasive breast carcinomas of which 154 were sporadic and 78 familial, 188 ductal and 44 lobular, from 232 female patients aged 25 to 87 years. The average follow-up period for overall survival was 161 months. Eighty-two patients experienced relapses, with an average follow-up for 161 months. In order to investigate the expression pattern of the proteins we applied the three-steps immunohistochemical method of the avidin - biotin - peroxidase complex, and to study the existence of mutations in exons 1 and 2 of the beta-catenin gene we used the polymerase chain reaction (PCR) method in 124 cases of invasive breast carcinomas. The statistical evaluation of the results and individual correlations was performed using univariate (chi-square test and log rank test) and multivariate (Cox's hazard regression model) analysis.Results: Axin protein was detected in the cytoplasm and the nucleus of cancer cells in 159 (68.5%) and 101 (43.5%) cases, respectively, as well as in the stromal fibroblasts in 159 (68.5%) cases. Concurrent cancerous and stromal immunostaining was observed in 121 (52.2%) cases. The conserved cytoplasmic protein expression was positively associated with lymph node status (p = 0.022), with the expression of HER-2 and GSK-3β proteins (p = 0.020 and p = 0.027, respectively) and inversely with the expression of Ki-67 and topoisomerase IIa (p = 0.011 and p = 0.031, respectively) proteins’ expression. Positive cytoplasmic staining of Axin was positively associated with stage (p = 0.028) and its nuclear expression showed a positive correlation with tumor size (p = 0.025). The localization of the protein in stromal fibroblasts showed a parallel association with lymph node status (p = 0.048) and the expression of HER-2 protein (p <0.001). Simultaneous immunodetection of Axin in the cytoplasm of cancer cells and in stromal fibroblasts was inversely correlated with the bcl-2 protein expression (p = 0.016). Neither cancerous nor stromal expression of the protein was found to exert any influence on overall and disease-free survival in the total of patients. However, in the subgroup of patients with invasive lobular breast cancer, conserved cytoplasmic localization of Axin was found to exert an unfavorable impact on patients’ overall survival (p = 0.024), in the univariate statistical analysis.The protein kinase GSK-3β was detected in the cytoplasm of cancer cells at a rate of 57.1% (133/233 cases) and in stromal fibroblasts in 28.7% (67/233 cases). The cytoplasmic localization of the protein was positively associated with the expression of HER-2 and Akt proteins (p = 0.045 and p = 0.039, respectively) and inversely correlated with the expression of PTEN protein (p = 0.011). The stromal expression of GSK-3β was positively correlated with the expression of caspase-3 (p = 0.020) and inversely with the expression of ER (p = 0.035), Ki-67 and Akt (p = 0.015 and p = 0.046, respectively) proteins’ expression. Neither cancerous nor stromal expression was associated with any of the classical clinicopathological parameters of breast cancer, and was not found to have any impact on overall and disease-free survival in the total of patients. However, in the subgroup of patients with HER-2 - negative breast carcinomas, cytoplasmic expression of GSK-3β was found to exert an unfavorable impact on disease-free survival (p = 0.021), in univariate statistical analysis.In exon 1 of the beta-catenin gene, mutations were detected at a rate of 13.7% (17/124 cases), which consisted of base substitutions in different nucleotide positions. By using the BLAST algorithm, we observed a perfect match (100% homology) between the first 7 base pairs of the internal ribosome entry segments (IRES) of the 5’ untranslated region of c-myc gene and nucleotide positions 111-117 of exon 1. Concerning exon 2, mutations were detected in18.5% (23/124 cases), which consisted of base substitutions in different nucleotide positions. The vast majority of these mutations (22/23, 95.6% of cases) were detected near nucleotide position 405, which lies within the second intron of the gene. Among these mutations, we observed a frequent change in the sequence from GAATTG to GAATAG, resulting in the creation of an AG dinucleotide, which could potentially serve as an alternative splice acceptor site. The other mutation was detected in the translation start codon (ATG).In conclusion, the results concerning Axin and GSK-3β proteins suggest that the degradation complex of beta-catenin is dysfunctional in the invasive breast carcinomas used in this study. Furthermore, it appears that beta-catenin itself is negatively regulated at the gene level, further supporting the hypothesis that the oncogenic pathway Wnt / beta-catenin is activated in the material of our study.

Ο καρκίνος του μαστού είναι η πιο συνηθισμένη κακοήθεια που εμφανίζεται στις γυναίκες. Μέχρι στιγμής, παρόλη την πρόοδο που έχει γίνει στον εντοπισμό και τη θεραπεία του καρκίνου του μαστού, η θνησιμότητα παραμένει ακόμη υψηλή. Σήμερα η έρευνα εστιάζεται στη μελέτη ανεύρεσης μοριακών προγνωστικών δεικτών που θα συμβάλλουν στην καλύτερη θεραπευτική αντιμετώπιση των ασθενών αυτών. Μεταξύ των βιολογικών δεικτών που μελετώνται, είναι οι δείκτες που έχουν σχέση με τις οδούς μηνυματοδότησης. Αυτές οι οδοί σχετίζονται με την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt/β-κατενίνη έχει θεωρηθεί σαν μια κεντρική ρυθμιστική οδός μετάφρασης πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της αύξησης, της μετανάστευσης και της επιβίωσης των καρκινικών κυττάρων και ως εκ τούτου συμμετέχει στην καρκινογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου του μαστού.Οι πρωτεΐνες Wnt αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια γλυκοπρωτεϊνών που δεσμεύονται στους αντίστοιχους υποδοχείς Frizzled. Το Wnt ρυθμίζει τουλάχιστον τρία διαφορετικά μονοπάτια, αλλά το καλύτερα μελετημένο είναι εκείνο της β-κατενίνης. Έχει δειχθεί πως ανωμαλίες αυτής της οδού οδηγούν σε διάφορες ανθρώπινες ασθένειες, όπως ο σχηματισμός όγκων και γενετικές ανωμαλίες των οστών.Σύμφωνα με το μοντέλο που είναι αποδεκτό για το μονοπάτι της β-κατενίνης, όταν το Wnt δεν δρα στα κύτταρα, σχηματίζεται ένα σύμπλοκο αποτελούμενο από τις πρωτεΐνες CKIα (κινάση Ια της καζεΐνης), GSK-3β (κινάση-3β της συνθάσης του γλυκογόνου), APC ( πρωτεΐνη της αδενωματώδους πολυποδίασης) και AXIN (αξίνη). Το σύμπλοκο αυτό φωσφορυλιώνει τη β-κατενίνη με επακόλουθο την αποικοδόμησή της στο κυτταρόπλασμα.Η ύπαρξη μεταλλάξεων στο εξώνιο 3 του γονιδίου της β-κατενίνης συνδέεται με επιθετικό φαινότυπο σε ορισμένα καρκινώματα, όπως του προστάτη, του ενδομητρίου και του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Στον καρκίνο του μαστού, ωστόσο, μεταλλάξεις σ’ αυτό το εξώνιο είναι σπάνιες ή απούσες.Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση του προτύπου έκφρασης των πρωτεϊνών του συμπλόκου αποικοδόμησης της β-κατενίνης AXIN, και GSK-3β σε 232 διηθητικά καρκινώματα μαστού (154 σποραδικά και 78 οικογενή) και της ύπαρξης τυχόν μεταλλάξεων στα εξώνια 1 και 2 του γονιδίου της β-κατενίνης σε 124 περιπτώσεις. Τα αποτελέσματα των ανωτέρω δεικτών υποβλήθηκαν σε στατιστική ανάλυση για τη διερεύνηση της σχέσης τους με α) Κλασικές κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους (ηλικία, εμμηνοπαυσιακή κατάσταση, μέγεθος όγκου, ιστολογικός τύπος, ιστολογικός και πυρηνικός βαθμός κακοήθειας, στάδιο της νόσου και ορμονικοί υποδοχείς), β) Ολική και ελευθέρα νόσου επιβίωση των ασθενών, γ) Νεότερους βιολογικούς δείκτες. Με βάση τις συσχετίσεις που προέκυψαν γίνεται εκτίμηση της πιθανής συμμετοχής των πρωτεϊνών αυτών, καθώς και των μεταλλάξεων της β-κατενίνης, στην επιθετικότητα και πρόγνωση του καρκίνου του μαστού.Το υλικό αποτέλεσαν 232 πρωτοπαθή διηθητικά καρκινώματα μαστού από τα οποία 154 ήταν σποραδικά και 78 οικογενή, 188 πορογενή και 44 λοβιακά, προερχόμενα από 232 θήλεις ασθενείς ηλικίας από 25 έως 87 έτη. Το μέσο διάστημα παρακολούθησης για την ολική επιβίωση των ασθενών ήταν 161 μήνες. Ογδόντα δύο ασθενείς εκδήλωσαν υποτροπές, με μέσο διάστημα παρακολούθησης 161 μήνες. Για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών εφαρμόστηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος τριών βημάτων του συμπλέγματος αβιδίνης – βιοτίνης – υπεροξειδάσης, ενώ για τη μελέτη της ύπαρξης μεταλλάξεων στα εξώνια 1 και 2 του γονιδίου της β-κατενίνης η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) σε 124 περιπτώσεις διηθητικών καρκινωμάτων μαστού. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων και των επιμέρους συσχετίσεων έγινε με μονοπαραγοντική (chi-square test και log rank test) και πολυπαραγοντική (Cox’s hazard regression model) ανάλυση.Αποτελέσματα: Η πρωτεΐνη Axin εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων σε 159 (68.5%) και 101 (43.5%) περιπτώσεις, αντίστοιχα, καθώς και στις στρωματικές ινοβλάστες σε 159 (68.5%) περιπτώσεις. Ταυτόχρονη καρκινική και στρωματική ανοσοεντόπιση παρατηρήθηκε σε 121 (52.2%) περιπτώσεις. Η διατηρημένη κυτταροπλασματική έκφραση της πρωτεΐνης συσχετίστηκε παράλληλα με τη διήθηση των επιχωρίων λεμφαδένων (p=0.022), παράλληλα με την έκφραση των πρωτεϊνών HER-2 και GSK-3β (p=0.020 και p=0.027, αντίστοιχα) και ανάστροφα με την έκφραση των πρωτεϊνών Ki-67 και τοποϊσομεράση ΙΙα (p=0.011 και p=0.031, αντίστοιχα). Η θετική κυτταροπλασματική έκφραση της AXIN συσχετίστηκε παράλληλα με το στάδιο της νόσου (p=0.028) και η πυρηνική της έκφραση παράλληλα με το μέγεθος του όγκου (p=0.025). Η εντόπιση της πρωτεΐνης στις στρωματικές ινοβλάστες συσχετίσθηκε παράλληλα με τη διήθηση των επιχωρίων λεμφαδένων (p=0.048) και με την έκφραση της πρωτεΐνης HER-2 (p<0.001). Η ταυτόχρονη ανοσοέκφραση της AXIN στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων και στις στρωματικές ινοβλάστες συσχετίστηκε ανάστροφα με την έκφραση της πρωτεΐνης bcl-2 (p=0.016). Καμία από τις ανοσοεντοπίσεις της πρωτεΐνης δεν βρέθηκε να ασκεί κάποια επίδραση στην ολική και ελευθέρα νόσου επιβίωση στο σύνολο των ασθενών. Ωστόσο, στην υποομάδα των ασθενών με διηθητικό καρκίνο του μαστού λοβιακού ιστολογικού τύπου, η διατηρημένη κυτταροπλασματική εντόπιση της AXIN βρέθηκε να ασκεί μη ευνοϊκή επίδραση στην ολική επιβίωση των ασθενών (p=0.024), στη μονοπαραγοντική στατιστική ανάλυση. Η πρωτεϊνική κινάση GSK-3β εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων σε ποσοστό 57.1% (133/233 περιπτώσεις) και στο 28.7% των στρωματικών ινοβλαστών (67/233 περιπτώσεις). Η κυτταροπλασματική εντόπιση της πρωτεΐνης συσχετίστηκε παράλληλα με την έκφραση των πρωτεϊνών HER-2 και Akt (p=0.045 και p=0.039, αντίστοιχα) και ανάστροφα με την έκφραση της πρωτεΐνης PTEN (p=0.011). Η στρωματική έκφραση της GSK-3β συσχετίστηκε παράλληλα με την έκφραση της κασπάσης-3 (p=0.020) και ανάστροφα με την έκφραση των ER (p=0.035) και των πρωτεϊνών Ki-67 και Akt (p=0.015 και p=0.046, αντίστοιχα). Καμία από τις ανοσοεντοπίσεις δεν συσχετίστηκε με κάποια από τις κλασικές κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους ούτε βρέθηκε να ασκεί κάποια επίδραση στην ολική και ελευθέρα νόσου επιβίωση, στο σύνολο των ασθενών. Ωστόσο, στην υποομάδα των ασθενών με HER-2 – αρνητικά καρκινώματα μαστού, η κυτταροπλασματική έκφραση της πρωτεΐνης βρέθηκε να ασκεί μη ευνοϊκή επίδραση στην ελευθέρα νόσου επιβίωση (p=0.021), στη μονοπαραγοντική στατιστική ανάλυση.Στο εξώνιο 1 του γονιδίου της β-κατενίνης ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις σε ποσοστό 13.7% (17/124 περιπτώσεις), οι οποίες αφορούσαν υποκαταστάσεις βάσεων σε διάφορες νουκλεοτιδικές θέσεις. Με τη χρήση του αλγορίθμου BLAST παρατηρήσαμε μια απόλυτη ταύτιση (100% ομολογία) μεταξύ των 7 πρώτων ζευγών βάσεων της εσωτερικής αλληλουχίας εισόδου των ριβοσωμάτων (IRES) της 5’ αμετάφρασης περιοχής του γονιδίου c-myc και των νουκλεοτιδικών θέσεων 111-117 του εξωνίου 1. Αναφορικά με το εξώνιο 2 μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν συνολικά σε ποσοστό 18.5% (23/124 περιπτώσεις), οι οποίες αφορούσαν υποκαταστάσεις βάσεων σε διάφορες νουκλεοτιδικές θέσεις. Η συντριπτική πλειοψηφία αυτών των μεταλλάξεων (22/23, 95.6% των περιπτώσεων) ανιχνεύθηκαν εγγύς της νουκλεοτιδικής θέσης 405, η οποία εντοπίζεται εντός του 2ου εσωνίου του γονιδίου. Μεταξύ αυτών των μεταλλάξεων, παρατηρήσαμε μια συχνή αλλαγή της αλληλουχίας από GAATTG σε GAATAG, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός δινουκλεοτιδίου AG, το οποίο θα μπορούσε δυνητικά να αποτελέσει μια εναλλακτική θέση συρραφής και ματίσματος. Η άλλη μετάλλαξη εντοπίστηκε εντός του κωδικονίου έναρξης της μετάφρασης (ATG).Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα των πρωτεϊνών Axin και GSK-3β υποδηλώνουν ότι το σύμπλεγμα αποικοδόμησης της β-κατενίνης είναι δυσλειτουργικό στα διηθητικά καρκινώματα μαστού της μελέτης αυτής. Παράλληλα, φαίνεται ότι η ίδια η β-κατενίνη υφίσταται αρνητική ρύθμιση σε γονιδιακό επίπεδο, γεγονός που ενισχύει την υπόθεση ότι το ογκογόνο μονοπάτι Wnt/β-κατενίνη είναι ενεργοποιημένο στο υλικό της μελέτης μας.