Μελέτη της επίδρασης της οικογένειας του EGFR στον καρκίνο του μαστού

Abstract

Introduction: HER-2 is overexpressed in 20–30% of breast cancer (BC), indicating poor prognosis. RANK downstream signaling pathways play a central role in BC. RANKL/RANK signaling pathway is implicated in HER-2(+) BC. The molecular mechanism of this implication remains to be elucidated. Aim: The aim of the dissertation is to investigate the implication of RANK receptor and NF-κB signaling pathway in the tumorigenesis of HER-2 (+) breast cancer (BC). Also, we tried to elucidate the molecular mechanisms underlying the regulation of RANKL/ RANK signaling by members of the EGFR family through putative physical interaction, affecting basic cellular properties. Finally, we examined the in vitro impact of the combined inhibition of RANK and HER-2 receptors in cancer cell development, which introduces new therapeutic strategies. Material and Methods: Human BC cell lines SKBR3, BT474, MCF7, MDA-MB-453 were used. The expression of RANK and RANKL was evaluated using RT-PCR, Western-Blot and immunofluorescence. The interaction between RANK and HER-2 was detected using Proximity Ligation Assay (PLA) which enables the visualization of interacting proteins. NF-κB pathway activation was studied using Western-Blot. The inhibitors trastuzumab (T), pertuzumab (P) and denosumab (D) of both pathways were used. The functional assays to study migration, apoptosis and proliferation were applied. Proliferation was evaluated using ΧTT and clonogenic assay, migration capacity via Scratch-Wound Healing Assay and apoptosis using flow cytometry analysis of annexin V and Propidium Iodite (PI) cell staining. Results: Cell lines express RANK and RANKL. RANK receptor dimerizes with EGFR family members. RANK / HER-2 dimer number was found associated with HER-2 expression (SKBR3: 5.4, BT-474: 8.2, MCF7: 0.7, MDA-MB-453: 0.3). RANK / HER-2 dimers were decreased in the presence of the inhibitors D, T and P, while they were increased after RANKL (R) treatment in SKBR3 cells (m:5.4, D:1.2, T:1.9, DT:0.6, TP:1, DTP:0.4, R:11.8,) and BT-474 (m:8.2, D:3.1, T:4.3, DT:0.7, TP:3.4, DTP:3.2, R:11.6). Combination targeting of SKBR3 cells further decreased NF-κB pathway activation compared to single targeting experiments. In SKBR3, RANKL and HER-2 blockage resulted in reduced cell proliferation, increased apoptosis and lower metastatic potential compared to mock cells (m) and reversed values upon RANKL presence. The combination treatment of SKBR3 cells with D, T and P had an advantage in functional traits compared to single targeting. Denosumab suppressed NF-κB signaling and diminished proliferation rate in MDA-MB-453 cells. MCF7 did not correspond to inhibitors. Conclusions: The results indicate a novel physical and molecular association between HER-2 and RANK pathways that affects HER-2 (+) BC growth. Our data suggest that the combination of anti-HER-2 agents and RANKL inhibitors have a potential direct anti-tumor effect and should be further tested in certain BC patients.

Εισαγωγή: Ο human epidermal growth factor receptor 2 (HER-2) υπερεκφράζεται στο 20-30% των περιπτώσεων καρκίνου του μαστού (ΚΜ) και σχετίζεται με κακή πρόγνωση. Σηματοδοτικά μονοπάτια καθοδικά του υποδοχέα receptor activator of nuclear factor-κB (RANK) παίζουν κεντρικό ρόλο στον ΚΜ. Το σηματοδοτικό μονοπάτι RANKL/RANK εμπλέκεται στον HER-2(+) ΚΜ. Ο μοριακός μηχανισμός της συμμετοχής του στην καρκινογένεση παραμένει αδιερεύνητος. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση της εμπλοκής του RANK υποδοχέα, και του σηματοδοτικού μονοπατιού του NF-κB στην ογκογένεση των HER-2(+) καρκινωμάτων μαστού (ΚΜ). Επιπλέον στόχος είναι η αποσαφήνιση του μοριακού μηχανισμού ρύθμισης της RANKL/RANK σηματοδότησης από μέλη της οικογένειας EGFR μέσω πιθανής φυσικής αλληλεπίδρασης, επηρεάζοντας βασικές κυτταρικές ιδιότητες. Τελικός στόχο της μελέτης αποτελεί η in vitro αξιολόγηση της συνδυαστικής αναστολής των RANK και EGFR υποδοχέων στην εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων γεγονός που συμβάλει σε νέες πιθανές θεραπευτικές προτάσεις. Υλικά και Μέθοδοι: Χρησιμοποιήθηκαν οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ΚΜ, SKBR3, BT474, MCF7, MDA-MB-453. Μελετήθηκε η έκφραση των RANK και RANKL, μέσω RT-PCR, Western-Blot και τεχνικές ανοσοφθορισμού. Η αλληλεπίδραση του RANK με τον HER-2 ανιχνεύθηκε μέσω της μεθόδου Proximity Ligation Assay (PLA), η οποία επιτρέπει την οπτικοποίηση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων. Η ενεργοποίηση του NF-κB μονοπατιού μελετήθηκε μέσω Western-Blot. Χρησιμοποιήθηκαν οι αναστολείς trastuzumab (T), pertuzumab (P), denosumab (D) των δύο μελετώμενων μονοπατιών. Εφαρμόστηκαν λειτουργικές δοκιμασίες μετανάστευσης, απόπτωσης και πολλαπλασιασμού. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός μελετήθηκε εκτιμώντας τη βιωσιμότητα των κυττάρων με τη δοκιμασία ΧTT και του clonogenic assay, το μεταναστευτικό δυναμικό με τη βιοδοκιμή προσομοίωσης τραύματος δι’ αμυχής (Scratch-Wound Healing Assay), ενώ η απόπτωση μέσω FACS έπειτα από χρώση των κυττάρων με ανεξίνη V. Αποτελέσματα: Η πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχεα RANK και του συνδέτη του RANKL εντοπίστηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Ο υποδοχέας RANK βρέθηκε ότι διμερίζεται με τα μέλη της οικογένειας EGFR. Ο αριθμός των διμερών RANK/ HER-2 ανά κύτταρο φαίνεται να εξαρτάται από την έκφραση του HER-2 (SKBR3:5.4,BT474:8.2,MCF7:0.7,MDA-MB-453:0.3). Τα διμερή RANK/ HER-2 μειώνονται παρουσία των αναστολέων Denosumab (D), Trastuzumab (T) και Pertuzumab (P), ενώ αυξάνονται παρουσία του RANKL (R) στα κύτταρα SKBR3 (m:5.4, D:1.2, T:1.9, DT:0.6, TP:1, DTP:0.4, R:11.8) και BT474 (m:8.2, D:3.1, T:4.3, DT:0.7, TP:3.4, DTP:3.2, R:11.6). Η συνδυαστική επώαση των κυττάρων SKBR3 με τους αναστολείς μειώνει περαιτέρω την ενεργοποίηση του μονοπατιού NF-κB σε σχέση με τη μονή στόχευση. Η αναστολή των RANKL και HER-2 στη κυτταρική σειρά SKBR3 έχει ως αποτέλεσμα τον μειωμένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αυξημένη απόπτωση και χαμηλότερο μεταναστευτικό δυναμικό συγκριτικά με τα κύτταρα ελέγχου (m) ενώ αντίθετες τιμές παρατηρήθηκαν παρουσία RANKL. Η συνδυαστική επώαση των κυττάρων SKBR3 με D, T και P πλεονεκτεί έναντι της μονής στόχευσης στις λειτουργικές δοκιμασίες. Το denosumab κατέστειλε την NF-κΒ σηματοδότηση και ελάττωσε το ρυθμό πολλαπλασιασμού στα καρκινικά κύτταρα MDA-MB-453. Η κυτταρική σειρά MCF7 δεν ανταποκρίθηκε στους αναστολείς. Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα μας καταδεικνύουν μια νέα φυσική και μοριακή συσχέτιση μεταξύ των HER-2 και RANK μονοπατιών, η οποία επηρεάζει την εξέλιξη των HER-2(+) ΚΜ. Επιπλέον, παρουσιάζονται ενδείξεις που καθιστούν τη συνδυαστική στόχευση των RANKL, HER-2 ως ωφέλιμη θεραπευτική στρατηγική, η οποία θα πρέπει να ελεγχθεί περαιτέρω σε συγκεκριμένους ασθενείς με ΚΜ.