Μοριακός χαρακτηρισμός γενετικού υλικού καρυδιάς και παράγοντες που επηρεάζουν την ποιότητα των καρπών της

Abstract

The objective of the present study was the molecular characterization of Greek walnut (Juglans regia L.) genetic material and the evaluation of factors that affect attributes and nutritional value of walnut endocarps. Greece could be considered as a long-established region of walnut diversity with a vast gene pool resource. However, there are no data about germplasm diversity and genetic relationships among walnut international cultivars and Greek local selections. The results in the present work, by the use of Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) markers, showed the presence of a high degree of genetic variability among the 56 examined accessions. Most international cultivars were grouped together, while most Greek native populations could not be placed into a distinct group. The Greek native population genotypes were found to be more diverse than the international cultivars. In the cultivar group, two subgroups were distinguished; one consisted of genotypes involving ‘Payne’ and the other ‘Franquette’ in their pedigrees. Genetic variation was larger among Greek walnut populations within a collection region than among the regions. The high variability of Greek germplasm suggests the importance of conservation of landrace Greek walnut populations. Dried kernels are the common product form of walnut cultivation. Among plant foodstuffs and especially nuts, walnut kernels are an excellent source of antioxidants and poly-unsaturated fatty acids (PUFA), especially omega-3 and omega-6. The study of dried kernels of four walnut cultivars (Chandler, Franquette, Hartley, Ioli) showed high levels of total phenolics (TP), total antioxidant capacity (TAC), assessed by FRAP and DPPH methods, and PUFA. The fatty acids (% in kernel oil) measured in this study were myristic, palmitic, palmitoleic, stearic, oleic (OL), vaccenic, linoleic (LL), linolenic (LL), arachidic and gondoic. Storage of kernels up to 12 mo resulted in browning and rancidity (hydrolytic and oxidative), high losses of TP and TAC, as well as, relatively low losses of mono-saturated fatty acids (MUFA), PUFA, OL, LL and LN. The highest deterioration of quality characteristics and particularly of nutritional value were observed at 20° C and/or under air, while the lower temperature (1° C) used and/or packaging under N₂ or CO₂ prevented additively the browning, the rancidity and the losses of TP, TAC, MUFA, PUFA, OL, LL and LN. Strong correlation was observed between TP and TAC, as well as between TP and kernel browning. Reverse correlation was found between rancidity and total unsaturated fatty acids (UFA), PUFA and LL. The results supported a probable protective effect of endogenous antioxidants against oxidation of UFA in walnut oil. Non-processed and non-dried walnuts, the so called fresh or wet walnuts, are a less widespread product of walnut cultivation, with a lack of storability information. The experiments showed that fresh walnut kernels of four cultivars (Chandler, Franquette, Hartley, Ioli) could be stored for at least 40 d at 1° C. During storage at 1° C, weight loss and decrease in respiration rates were observed along with browning, without any other decay, while no ethylene production was detected. On the contrary, great increases in TP and TAC were observed during storage, suggesting the enhancement of nutritional value of the product at 1° C. Exposure at 1° C for 20 d resulted in increased TP levels in walnuts even after drying in comparison with dried walnuts without prior exposure. Storage of in-shell kernels at 1° C resulted in a slight decrease in kernel browning, but had no effect on the increased TP and TAC levels in comparison with shelled ones. Shell strength did not change during the whole storage period. Exposure of ‘Franquette’ shelled kernels at 1° C resulted in increases in concentration of phenolic acids 4-hydroxybenzoic (HB), 2,4-dihydroxybenzoic (DHB), protocatechuic (PC), vanillic (VA), syringic (SY) and ellagic (EL) along with the increases in TP and TAC. By contrast, these variables remained almost stable at 8° C except for the increases in HB and SY. Protocatechuic ethyl ester (PCE) decreased at both temperatures. All phenolic compounds were identified by mass spectrometry (HPLC-MS), while DHB and PCE were first identified in walnut kernel in this study. At 1° C, phenolic increases could probably be derived from the induction of phenylpropanoid metabolism (PhP), since increased activities (specific and total) of the enzymes phenylalanine ammonia-lyase (PAL), polyphenoloxidase (PPO) and peroxidase (POD) were found. The use of inhibitors of PAL activity, as well as, of mRNA, RNA and protein synthesis revealed that the increased activities of PAL, PPO and POD were probably derived from both activation and de novo synthesis of these enzymes. The combined results at 1° C suggested that PhP was responsible for the increases in HB, DHB, VA and SY, but not for the increases in PC, whereas PhP contributed partially, to the biosynthesis of EL. The quality and composition of ‘Franquette’ fresh walnuts were also studied 43 d and 84 d after branch girdling at the state of the beginning of kernel increase. During fruit maturation, increases in PUFA and LL in kernel oil were observed in all samples, along with the increases in kernel weight and oil content. By contrast, TP, TAC, saturated fatty acids (SFA) and PA decreased. In both kernels and leaves, concentrations of sucrose, fructose and glucose decreased and CO₂ assimilation rates of leaves reduced. Girdling resulted in precocity, improved uniformity of fruit load maturation, increased kernel weight and kernel oil content. Girdling had no negative effect on kernel quality according to either consumer perception (color, free fatty acids, peroxide value) or nutritional value (TP, TAC, oil composition in fatty acids).

Ο αντικειμενικός σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν ο μοριακός χαρακτηρισμός του ελληνικού γενετικού δυναμικού της καρυδιάς (Juglans regia L.) και η μελέτη παραγόντων που επηρεάζουν τα χαρακτηριστικά των καρπών της που εκτιμώνται ιδιαίτερα σε διεθνές επίπεδο για τη θρεπτική τους αξία. Η Ελλάδα είναι από τις πρώτες γεωγραφικές περιοχές της Ευρώπης όπου καλλιεργήθηκε η καρυδιά. Ωστόσο, δεν υπάρχουν στοιχεία για τη γενετική παραλλακτικότητα και τις γενετικές σχέσεις μεταξύ των διεθνώς καλλιεργούμενων ποικιλιών και των ελληνικών τοπικών πληθυσμών καρυδιάς, οι οποίες εξετάσθηκαν στην παρούσα μελέτη με τη χρήση ISSR (Inter Simple Sequence Repeat -Ενδο-μικροδορυφορικές επαναλήψεις) δεικτών. Από τα αποτελέσματα προέκυψε η ύπαρξη υψηλής γενετικής παραλλακτικότητας μεταξύ των 56 εξεταζόμενων γονοτύπων, με τις περισσότερες διεθνείςποικιλίες να αποτελούν μια διακριτή ομάδα, σε αντίθεση με τις ελληνικές επιλογές οι οποίες δεν μπορούν να θεωρηθούν σαν ένα ομοιογενές σύνολο. Στην ομάδα των διεθνών ποικιλιών διακρίθηκαν δύο υποομάδες, όπου στη μια συμμετέχουν κυρίως ποικιλίες που έχουν την ‘Payne’ στη γενεαλογία τους, ενώ στη δεύτερη συμμετέχουν ποικιλίες που έχουν την ‘Franquette’ στη γενεαλογία τους ή είναι γαλλικές επιλογές. Η υψηλή παραλλακτικότητα του ελληνικού γενετικού υλικού που αποκαλύφθηκε, κατανεμήθηκε κυρίως εντός των γεωγραφικών περιοχών καλλιέργειάς τους παρά μεταξύ αυτών, γεγονός που καθιστά επιτακτική την ανάγκη προστασίας και διατήρησης του υλικού αυτού. Τα αποξηραμένα σπέρματα του καρπού της καρυδιάς αποτελούν το κύριο προϊόν της καλλιέργειάς της, τα οποία θεωρούνται μοναδικά μεταξύ των ξηρών καρπών και των φυτικών τροφών γενικότερα, καθώς έχουν πολύ ισχυρή ολική αντιοξειδωτική ικανότητα (TAC) και εξαιρετική σύσταση καρυδέλαιου σε λιπαρά οξέα (FA). Η μελέτη αποξηραμένων σπερμάτων τεσσάρων ποικιλιών (Chandler, Franquette, Hartley, Ιόλη) έδειξε για όλες τις ποικιλίες πολύ υψηλά επίπεδα ολικών φαινολικών (ΤΡ), TAC (εκτιμώμενη με τις μεθόδους FRAP και DPPH) και το κλάσμα πολύ-ακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFA). Προσδιορίστηκαν τα λιπαρά οξέα μυριστικό, παλμιτικό, παλμιτελαϊκό, στεαρικό, ελαϊκό (OL), βαχενικό, λινελαϊκό (LL), λινολενικό (LN), αραχιδικό και γονδοϊκό. Kατά τη συντήρηση έως και 12 mo, παρατηρήθηκαν προοδευτικό καφέτιασμα (μείωση h° και L*), αύξηση των ελεύθερων λιπαρών οξέων (FFA) και του βαθμού υπεροξειδίων (PV), μεγάλες απώλειες TP και TAC, και σχετικά μικρές απώλειες των κλασμάτων των μόνο-ακόρεστων λιπαρών οξέων (MUFA), PUFA, καθώς και των OL, LL (ω-6) και LN (ω-3). Η μεγαλύτερη υποβάθμιση της ποιότητας και της θρεπτικής αξίας παρατηρήθηκε σε θερμοκρασία συντήρησης 20° C ή/και σεσυσκευασία αέρα, ενώ η χαμηλή θερμοκρασία συντήρησης (1ο C) ή/και η συσκευασία σε Ν₂ ή CO₂ περιόρισαν το καφέτιασμα, τις αυξήσεις των FFA και PV, καθώς και τις απώλειες των ΤΡ, ΤΑC, MUFA, PUFA, OL, LL και LN. Οι θετικές επιδράσεις της χαμηλής θερμοκρασίας και του μειωμένου Ο₂ στην ατμόσφαιρα συντήρησης ήταν προσθετική. Παρατηρήθηκε στενή σχέση μεταξύ TP και TAC, αλλά και μεταξύ ΤΡ και καφετιάσματος των σπερμάτων. Παράλληλα, βρέθηκε αρνητική συσχέτιση ανάμεσα στο τάγγισμα (FFA, PV) και τα ακόρεστα λιπαρά οξέα (UFA), PUFA και LL και επιπρόσθετα παρατηρήθηκε ότι υπάρχει μια προστατευτική δράση των ενδογενών αντιοξειδωτικών επί της οξείδωσης των UFA του καρυδέλαιου. Οι μη αποξηραμένοι καρποί καρυδιάς (νωπά ή φρέσκα καρύδια) αποτελούν ένα λιγότερο διαδεδομένο προϊόν της καλλιέργειας αυτού του φυτικού είδους, για το οποίο δεν υπάρχουν στοιχεία που αφορούν την ποιότητα και τη συντήρησή του. Από τη μελέτη της συντήρησης, νωπών σπερμάτων από τις τέσσερεις ποικιλίες που μελετήθηκαν ωςαποξηραμένες, προέκυψε η δυνατότητα συντήρησης και των τεσσάρων ποικιλιών τουλάχιστο μέχρι 40 d στον 1° C. Κατά τη συντήρηση, παρατηρήθηκε απώλεια βάρους και μείωση του ρυθμού αναπνοής, προοδευτικό καφέτιασμα, χωρίς άλλη αλλοίωση, αλλά σημαντική αύξηση των επιπέδων TP και TAC, ενώ η έκλυση αιθυλενίου ήταν μη ανιχνεύσιμη. Η συντήρηση των σπερμάτων με-κέλυφος περιόρισε ελαφρά το κεφέτιασμα, χωρίς όμως να έχει επίδραση επί των TP και της TAC, ενώ αλλαγές στη σκληρότητα του κελύφους δεν παρατηρήθηκαν. Σε καρύδια που αποξηράνθηκαν μετά την έκθεσή τους ως νωπά στον 1° C έως και 20 d, η βελτίωση της θρεπτικής αξίας των σπερμάτων μέσω της αύξησης των TP παρέμεινε ακόμα και μετά την αποξήρανση. Η έκθεση νωπών σπερμάτων ‘Franquette’ χωρίς κέλυφος στον 1° C συνετέλεσε σε αυξήσεις συγκεντρώσεων των φαινολικών οξέων 4-υδροξυβενζοϊκό (ΗΒ), 2,4-διϋδροξυβενζοϊκό (DHB), βανιλλικό (VA), συρινγικό (SY), πρωτοκατεχικό (PC) και ελλαγικό (EL) παράλληλα με τις αυξήσεις των TP και TAC. Αντίθετα, οι παραπάνω αυξήσεις δεν παρατηρήθηκαν κατά την έκθεση των σπερμάτων στους 8° C, εκτός από μικρές αυξήσεις των HB και SY. Ο αιθυλεστέρας του πρωτοκατεχικού (PCE) παρουσίασε μείωση σε όλες τις συνθήκες. Όλα τα φαινολικά ταυτοποιήθηκαν με τη χρήση φασματογράφου μαζών (HPLCMS) και τα DHB και PCE προσδιορίστηκαν για πρώτη φορά στην καρυδιά. Οι αυξήσεις των φαινολικών στον 1° C πιθανόν να προήλθαν από την ενεργοποίηση του μεταβολισμού των φαινυλπροπανοειδών (PhP), καθώς παρατηρήθηκαν αυξημένες ενεργότητες (ειδική και ολική) του ενζύμου φαινυλαλανίνη αμμωνία-λυάση (PAL). Με τη χρήση παρεμποδιστών της δράσης της PAL, καθώς και της σύνθεσης mRNA, RNA και πρωτεϊνών βρέθηκε ότι η αύξηση της ενεργότητας (ειδικής και ολικής) των ενζύμων πολυφαινολοξειδάση (PPO) και υπεροξειδάση (POD), καθώς και της PAL προήλθε τόσο από την ενεργοποίησή τους όσο και πιθανόν από τη de novo σύνθεσή τους. Ο συνδυασμός των αποτελεσμάτων έδειξε ότι είναι πιθανόν η συσσώρευση των φαινολικών οξέων HB, DHB, VA και SY να γίνεται μέσω του PhP, του PC εκτός του PhP, ενώ στη συσσώρευση του EL είναι πιθανόν να συνεισφέρει μερικώς το PhP. Τέλος, εξετάστηκε η ποιότητα και η σύσταση των νωπών σπερμάτων της ‘Franquette’ 43 d και 84 d μετά την εφαρμογή δακτυλίωσης κατά το στάδιο έναρξης της ανάπτυξης του σπέρματος σε τετραετείς κλάδους. Κατά την ωρίμανση καρπών με ή χωρίς δακτυλίωση παρατηρήθηκε αύξηση των PUFA και του LL στο καρυδέλαιο παράλληλα με την αύξησητου βάρους και της ελαιοπεριεκτικότητας του σπέρματος. Αντίθετα, βρέθηκε πτωτική τάση των επιπέδων των ΤΡ, της ΤAC, των κορεσμένων λιπαρών οξέων (SFA) και του παλμιτικού οξέως (ΡΑ). Τόσο στα σπέρματα όσο και στα φύλλα η σακχαρόζη, φρουκτόζη και γλυκόζη είχαν πτωτική τάση στην πορεία του χρόνου, όπως επίσης παρόμοια πτωτική τάση είχε και ο ρυθμός αφομοίωσης CO₂ των φύλλων. Η δακτυλίωση οδήγησε σε πρωίμιση των καρπών και μεγαλύτερη ομοιομορφία του φορτίου, αυξημένο βάρος σπέρματος και ελαιοπεριεκτικότητα των ώριμων καρπών, ενώ δεν επηρέασε άλλα χαρακτηριστικά της ποιότητας του σπέρματος, τόσο με βάση την αντίληψη του καταναλωτή (χρώμα, FFA, PV), όσο και από την άποψη της θρεπτικής αξίας (TP, TAC, σύσταση καρυδέλαιου σε λιπαρά οξέα).