Τεχνολογία δευτερογενών μεταβολιτών: Σχεδιασμός, ανάπτυξη και φαρμακολογική αξιολόγηση καινοτόμων συστημάτων μεταφοράς και αποδέσμευσης αλκαννινών/σικονινών

Abstract

The present doctoral thesis concerns the design, development and characterization of innovative drug delivery systems for shikonin, alkannin and their derivatives), which are naturally occurring compounds with a well-established wound healing, antibiotic, anti-inflammatory and anticancer activity. Our aim was to combine the biological properties of the bioactive constituents together with the advantages of drug delivery systems, in order to achieve controlled release and targeted drug delivery. Thus, conventional and pegylated (stealth®) liposomes, as well as dendritic formulations and chimeric-advanced Drug Delivery nanoSystems (chi-aDDnSs) were prepared as innovative drug delivery systems for shikonin. Furthermore, electrospinning was applied for the fabrication of nanofibers loaded with shikonin and with a mixture of alkannin/shikonin esters isolated from the roots of Alkanna tinctoria, as potent topical/transdermal wound healing dressings. Two type of lipids (Egg-PC and DPPC), and various drug concentrations were tested for the preparation of conventional liposomes. Mean particle size was found between 120 και 280 nm, while z- potential values varied from -4 mV to -17 mV. All liposomal formulations exhibited entrapment efficiency higher than 60%, while a controlled release of the drug was achieved. The shikonin-loaded liposomes tested for their in vitro cytotoxic activity, showed a moderate growth inhibitory activity against two tumor cell lines (MCF7-breast cancer and SF268-glioma). Shikonin-loaded pegylated liposomes were prepared using three types of lipids (Egg-PC, DSPC, DPPC) and DSPE-mPEG2000as stabilizing agent. Compared to conventional liposomes, pegylated liposomes exhibited enhanced physicochemical characteristics (lower mean sizes and higher ζ-potential values), as well as improved stability. Finally, pegylated liposomes were characterized by a prolonged drug release profile lasting for over 72 hours. Three generations of hyper-branched polymers (HP) (PFH-16-OH, PFH-32-OH και PFH-64-OH) were used for the preparation of dendritic liposomes, from which the G4 polymer exhibited the higher entrapment efficiencies. Entrapment efficiency was further enhanced when methanol was used during the complexation process. Finally, the prepared samples exhibited moderate stability at 4°C, for a 48h period. Chimeric-advanced Drug Delivery nanoSystems (chi-aDDnSs) where prepared by entrapping shikonin-HP complexes into Egg-PC liposomes. The size of the prepared aDDnSs was comparable to that of conventional shikonin-loaded liposomes, while entrapment efficiency was found to depend on the preparation technique used. Finally, the liposomal formulations exhibited enhanced stability at 4°C, while their drug release profile was also satisfactory. Four different biodegradable polymers (CA, PLLA, PLGA 50:50 and PLGA 75:25) and various initial drug loadings (bioactive constituent: shikonin or mixture of alkannins/shikonin esters) were tested for the preparation of electrospun nanofibers. The prepared e-spun fibers exhibited satisfactory morphology (mean sizes were in the nanoscale) and high entrapment efficiencies, depending on the type of polymer used and the initial drug loading. Drug release profile was also satisfactory, while in all cases a burst release was observed during the first 60 min. The novel alkannin/shikonin-loaded drug delivery systems prepared in this thesis appear promising and could be further exploited to increase the therapeutic index of the incorporated bioactive constituents.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή μελετά το σχεδιασμό, την ανάπτυξη και τον χαρακτηρισμό καινοτόμων συστημάτων μεταφοράς και αποδέσμευσης για τη βιοδραστική ουσία σικονίνη, αλκαννίνη και τα παράγωγά της, οι οποίες εμφανίζουν ισχυρή επουλωτική, αντιμικροβιακή, αντιφλεγμονώδη και αντικαρκινική δράση. Στόχος ήταν να συνδυαστούν οι βιολογικές ιδιότητες της φυσικών αυτών προϊόντων με τα πλεονεκτήματα που προσφέρουν τα συστήματα μεταφοράς φάρμακου, επιτυγχάνοντας ελεγχόμενη αποδέσμευση στην επιθυμητή περιοχή δράσης. Για το σκοπό αυτό, παρασκευάσθηκαν συμβατικά και σταθεροποιημένα λιποσωμιακά συστήματα, δενδριτικά συστήματα, καθώς και χιμαιρικά λιποσωμιακά συστήματα (συνδυάζοντας την δενδριτική με την λιποσωμιακή τεχνολογία) μεταφοράς και αποδέσμευσης για τη σικονίνη. Τέλος, παρασκευάσθηκαν νανοΐνες ηλεκτροστατικής ινοποίησης από διάφορα βιοαποκοδομήσιμα πολυμερή με δραστική ουσία σικονίνη ή μίγμα αλκαννίνης/σικονίνης και εστέρων τους, που απομονώθηκε από τις ρίζες του φυτού Alkanna tinctoria, ως σκεύασμα εξωτερικής χρήσης με επουλωτική και αντιμικροβιακή δράση. Για την παρασκευή των συμβατικών λιποσωμιακών σκευασμάτων χρησιμοποιήθηκαν δύο τύποι λιπιδίων (Egg-PC και DPPC) και διάφορες αρχικές συγκεντρώσεις σικονίνης. Το μέσο μέγεθος των σωματιδίων κυμαίνεται μεταξύ 120 και 280 nm, ενώ οι τιμές ζ-δυναμικού τους μεταξύ -4 mV έως -17 mV. Τα ποσοστά εγκλεισμού τους βρέθηκαν μεγαλύτερα από 60%, ενώ επιβεβαιώθηκε η επιθυμητή ελεγχόμενη αποδέσμευση της δραστικής ουσίας. Τέλος, τα παρασκευασθέντα δείγματα εμφάνισαν ικανοποιητική in vitro κυτταροτοξική δράση σε δύο καρκινικές σειρές (MCF7-καρκίνος του μαστού και SF268-γλοίωμα). Τα στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσωμιακά συστήματα σικονίνης παρασκευάσθηκαν με τρεις τύπους λιπιδίων (Egg-PC, DSPC, DPPC) και με σταθεροποιητικό παράγοντα DSPE-mPEG2000. Εμφανίζουν βελτιωμένα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά (μικρότερο μέσο μέγεθος, υψηλότερες τιμές ζ-δυναμικού), υψηλότερα ποσοστά εγκλεισμού, καθώς και αυξημένη σταθερότητα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα συμβατικά λιποσώματα σικονίνης. Τέλος, χαρακτηρίζονται από παρατεταμένη αποδέσμευση δραστικής ουσίας που φτάνει μέχρι τις 72 ώρες. Τρεις γενιές υπερδιακλαδισμένων πολυμερών (ΥΠ) (PFH-16-OH, PFH-32-OH και PFH-64-OH) χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή δενδριτικών συστημάτων μεταφοράς και αποδέσμευσης σικονίνης, με το υπερδιακλαδισμένο πολυμερές 4ης γενιάς (PFH–64–OH) να εμφανίζει πάντοτε το υψηλότερο ποσοστό εγκλεισμού. H χρήση μεθανόλης κατά τη διεργασία της συμπλοκοποίησης αυξάνει την αποτελεσματικότητα του εγκλεισμού. Τέλος, τα δείγματα εμφάνισαν μέτρια σταθερότητα κατά την παραμονή τους στους 4°C. Τα χιμαιρικά λιποσωμιακά συστήματα σικονίνης (chi-aDDnSs), παρασκευάσθηκαν με εγκλωβισμό των συμπλόκων σικονίνης/ΥΠ σε λιποσώματα με λιπίδιο Egg-PC. Το μέσο μέγεθός τους βρέθηκε ανάλογο με των αντίστοιχων συμβατικών λιποσωμάτων, ενώ η αποτελεσματικότητα του εγκλεισμού φάνηκε να εξαρτάται από τη μέθοδο παρασκευής που χρησιμοποιήθηκε. Τα χιμαιρικά λιποσωμιακά συστήματα, αύξησαν την σταθερότητα των συμπλόκων σικονίνης/ΥΠ, ενώ χαρακτηρίζονται και από ικανοποιητικό προφίλ αποδέσμευσης. Για την παρασκευή νανοϊνών ηλεκτροϊνοποίησης χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα βιοποικοδομήσιμα πολυμερή (CA, PLLA, PLGA 50:50 και PLGA 75:25), καθώς και διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις σικονίνης και μίγματος εστέρων αλκαννίνης/σικονίνης. Οι παρασκευασθείσες νανοΐνες παρουσιάζουν ιδιαίτερα ικανοποιητική μορφολογία (με μεγέθη στην κλίμακα των νανομέτρων) και υψηλά ποσοστά εγκλεισμού που εξαρτώνται από τον τύπο του χρησιμοποιούμενου πολυμερούς και την αρχική συγκέντρωση φαρμακευτικής ουσίας. Το προφίλ αποδέσμευσης της δραστικής ουσίας είναι ικανοποιητικό, ενώ σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκε έντονη αρχική αποδέσμευσή της (burst release) κατά τα πρώτα 60 λεπτά του πειράματος. Τα συστήματα μεταφοράς και αποδέσμευσης που αναπτύχθηκαν στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής εμφανίζουν ιδιαίτερα πλεονεκτήματα και μπορούν να χρησιμοποιηθούν ώστε να αυξηθεί ο θεραπευτικός δείκτης των δραστικών ουσιών που εγκλείστηκαν.