Επίδραση πεπτιδίων γάλακτος στην απορρόφηση σιδήρου

Abstract

Bovine milk provides iron of low bioavailability and inhibits absorption of nonheme iron present in a meal, but small peptides released during proteolytic digestion are thought to have a promoting effect on iron absorption. There is little knowledge on the effect of peptides, released during the gastrointestinal digestion of milk, on the bioavailability of iron. Our overall objective was to investigate whether peptidic fractions isolated during the in vitro digestion of milk have a promoting effect on iron absorption. The specific objectives were a) to isolate peptidic fractions following the in vitro digestion of cow’s milk, using gel filtration b) to test the effect of peptidic fractions on iron solubility at pH that simulates the gastrointestinal environment c) to study the effect of these fractions on iron uptake by Caco-2 cells and on gene expression of DMT1, a transporter of iron d) to predict the bioavailability of iron from foods (milk, infant fruit or vegetable meal) that are formulated with added milk peptidic fractions e) to determine whether milk peptidic fractions improve the bioavailability of iron intrinsically present in a corn and soybean diet by young pigs using the hemoglobin repletion assay. Peptidic fractions were isolated by gel filtration, after a simulated gastrointestinal digestion of milk and were incubated with ferric chloride at pH 5.7 for 15 min. Two of the peptidic fractions enhanced iron solubility. Subsequently it was observed that these fractions increased iron uptake by Caco-2 cells by 2.8- and 3.5- fold compared to control (PIPES buffer). The enhancing effect of these fractions was significant when compared to the effect of non-fractionated milk digest (p<0.0001) or to the effect of other peptidic fractions. Both fractions enhanced iron uptake by Caco-2 cells with a dose-effect relationship. These peptidic fractions may not affect the relative gene expression of DMT1 in Caco-2 cells. A synthetic hexapeptide of bovine β-casein (f63-68), PGPIPN, increased iron uptake by Caco-2 cells. The synthetic tripeptide LLY of bovine β-casein (f191-193) exhibited no effect on iron solubility or uptake by Caco-2 cells. Milk peptidic fractions were further investigated for their property to preserve their enhancing effect after in vitro digestion. It was shown that the fractions tested preserve their enhancing properties on iron dialyzability after in vitro digestion but they have a limited effect when added to milk or in an infant vegetable or fruit meal. In milk, peptidic fractions did not affect iron dialyzability, but lyophilized peptidic fractions enhanced iron dialyzability by approximately 30%. Finally, a milk peptidic fraction added to the diet of young piglets did not improve iron bioavailability intrinsically presented in the corn and soy based diet, measured with the hemoglobin repletion assay. Iron bioavailability was improved (p=0.04) only during the first two weeks of the experiment but not during the three weeks of the experiment. The innovative study presented herein has initiated orchestrated efforts that elucidate the effect of milk peptides on iron absorption. The results of the study suggest that milk peptidic fractions may enhance the bioavailability of iron from meals; however this property needs to be further investigated in order to accurately recognize factors that have a detrimental effect in the expression of this property. Further research may provide an in depth understanding of the interactions of milk peptides with iron in vivo as well as valuable information regarding potential applications

Το αγελαδινό γάλα παρέχει σίδηρο χαμηλής βιοδιαθεσιμότητας και παρεμποδίζει την απορρόφηση του μη-αιμικού σιδήρου από ένα γεύμα. Ωστόσο, πεπτίδια που απελευθερώνονται κατά την ενζυματική πέψη του γάλακτος είναι πιθανό να αυξάνουν την απορρόφηση του σιδήρου. Δεν υπάρχει πλήρης επιστημονική τεκμηρίωση σχετικά με την επίδραση που ασκούν στην απορρόφηση του σιδήρου, πεπτίδια που απελευθερώνονται κατά την γαστρεντερική πέψη του γάλακτος. Στόχος της διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης πεπτιδικών κλασμάτων γάλακτος στην απορρόφηση του σιδήρου. Οι επιμέρους στόχοι ήταν: α) η απομόνωση πεπτιδικών κλασμάτων μετά από in vitro πέψη αγελαδινού γάλακτος, μέσω χρωματογραφίας διήθησης πηκτής, β) η εξέταση της επίδρασης των πεπτιδικών κλασμάτων στη διαλυτότητα του σιδήρου σε pH που προσομοιάζει το γαστρεντερικό περιβάλλον, γ) η μελέτη της επίδρασης αυτών των κλασμάτων στη πρόσληψη σιδήρου από Caco-2 κύτταρα και στην γονιδιακή έκφραση του DMT1, ο οποίος είναι μεταφορέας σιδήρου στο εντεροκύτταρο δ) η πρόβλεψη της βιοδιαθεσιμότητας του σιδήρου από τρόφιμα (γάλα, βρεφικό γεύμα φρούτων ή λαχανικών) στα οποία προστέθηκαν τα πεπτιδικά κλάσματα και ε) η μελέτη σε χοιρίδια της επίδρασης πεπτιδικού κλάσματος γάλακτος στη βιοδιαθεσιμότητα σιδήρου από σιτηρέσιο βασισμένο σε αραβόσιτο και σόγια, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ανασύστασης αιμοσφαιρίνης. Τα πεπτιδικά κλάσματα απομονώθηκαν μέσω χρωματογραφίας διήθησης πηκτής μετά από in vitro πέψη γάλακτος, διαδικασία που προσομοιάζει την γαστρεντερική πέψη, και επωάστηκαν με τριχλωριούχο σίδηρο σε pH 5.7 για 15 min. Δύο από αυτά τα πεπτιδικά κλάσματα αύξησαν τη διαλυτότητα του σιδήρου. Στη συνέχεια παρατηρήθηκε ότι αυτά τα κλάσματα αύξησαν τη πρόσληψη σιδήρου, με σχέση δόσης-απόκρισης, από κύτταρα Caco-2 κατά 2.8- και 3.5- φορές σε σχέση με το μάρτυρα (ρυθμιστικό διάλυμα). Η αύξηση αυτή ήταν σημαντική σε σχέση με την αύξηση που προκάλεσε το μη-κλασματοποιημένο προϊόν πέψης γάλακτος (p<0.0001) ή άλλα πεπτιδικά κλάσματα. Το συνθετικό εξαπεπτίδιο της βόειας β-καζεΐνης, PGPIPN (τμήμα αλληλουχίας αμινοξέων 63-68) αύξησε την πρόσληψη σιδήρου από Caco-2 κύτταρα. Το συνθετικό τριπεπτίδιο LLY της βόειας β-καζεΐνης (τμήμα αλληλουχίας αμινοξέων 191-193) δεν άσκησε καμμία επίδραση στη διαλυτότητα του σιδήρου ή στη πρόσληψη σιδήρου από Caco-2 κύτταρα. Στη συνέχεια εξετάστηκε εάν αυτή η επίδραση στην πρόσληψη σιδήρου ασκείται μέσω αύξησης της σχετικής γονιδιακής έκφρασης του DMT1 στα κύτταρα Caco-2. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, αυτά τα πεπτιδικά κλάσματα πιθανώς δεν επηρεάζουν την έκφραση του γονιδίου που κωδικοποιεί τον DMT1. Τα πεπτιδικά κλάσματα γάλακτος διερευνήθηκαν ακολούθως όσον αφορά στην ιδιότητά τους να διατηρούν την δραστικότητά τους μετά από in vitro πέψη. Παρατηρήθηκε ότι τα κλάσματα που εξετάστηκαν διατήρησαν την δραστικότητά τους στη διαλυτότητα του σιδήρου μετά από in vitro πέψη αλλά είχαν περιορισμένη επίδραση όταν προστέθηκαν σε γάλα, ή σε βρεφικό γεύμα φρούτων ή λαχανικών. Στο γάλα, τα πεπτιδικά κλάσματα δεν επηρέασαν τη διαλυτότητα του σιδήρου, αλλά λυοφιλιωμένα πεπτιδικά κλάσματα αύξησαν τη διαλυτότητα του σιδήρου κατά περίπου 30%. Τέλος, ένα πεπτιδικό κλάσμα γάλακτος που προστέθηκε στο σιτηρέσιο χοιριδίων δεν αύξησε την βιοδιαθεσιμότητα του σιδήρου που υπήρχε σε σιτηρέσιο βασισμένο σε αραβόσιτο και σόγια. Η βιοδιαθεσιμότητα μετρήθηκε με τη μέθοδο ανασύστασης της αιμοσφαιρίνης. Στατιστικά σημαντική αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας (p=0.04) παρατηρήθηκε μόνο κατά τις δύο πρώτες εβδομάδες του πειράματος αλλά όχι κατά τη διάρκεια των τριών εβδομάδων του πειράματος. Η καινοτόμος έρευνα που παρουσιάζεται σε αυτή τη διατριβή αποτελεί έναρξη συντονισμένων προσπαθειών που διαφωτίζουν την επίδραση πεπτιδίων γάλακτος στην απορρόφηση του σιδήρου. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι πεπτιδικά κλάσματα γάλακτος μπορεί να ενισχύουν τη βιοδιαθεσιμότητα του σιδήρου αν και η ιδιότητα αυτή των πεπτιδίων γάλακτος πρέπει να μελετηθεί περαιτέρω ώστε να διερευνηθούν πλήρως ο μηχανισμός της αλληλεπίδρασης των πεπτιδίων γάλακτος με το σίδηρο αλλά και οι ενδεχόμενες εφαρμογές σε νέα τρόφιμα.