Μοριακή διερεύνηση κληρονομικής παραμονής εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης σε ενήλικες και μελέτη των συνδεόμενων πρωτεϊνικών παραγόντων

Abstract

Ιn the present study the cis-sequences of the γ-globin genes were studied for the presence of elevated fetal hemoglobin in patients with various thalassemias [β-, δβ- thalassemia and hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH)], so that the interaction mechanisms in the expression of the globin genes could be understood. 160 patients with β-thalassemia were studied, including patients with β-thalassemia and elevated HbF (52 subjects), δβ- thalassemia (63 subjects) and HPFH (30 subjects). The results can be seen below:a) the distribution of thalassemic mutations in Central Greece are similar to the ones observed in the rest of the country. The –MED deletion of the α-globin gene and deletion/inversion of the Turkish type are the most frequent genetic redistribution. The -101 (CT) mutation of the β-globin gene promoter is present in significantly high frequency in Central Greece.b) Here, we provide evidence for three new gene conversion events in the 5’ regulatory region of the human fetal globin genes. The sequence variations are transcriptionally silent polymorphisms that do not contribute to increased fetal hemoglobin levels, suggesting that the 5’ regulatory region of the human fetal globin genes is a gene conversion hot spot that prevent globin gene promoter sequence diversification, further underlining the need for two functional fetal globin genes in fetal erythropoiesis.c) a novel nd-HPFH mutation in the HBG2 gene promoter (HBG2:g.-109G>T). This mutation results in elevated HbF levels (4.1, 14.3%), significantly increased Gγ-globin chain production (79.2%) and markedly improved hematological indices. HBG2:g.-109G>T mutation abolishes a transcription factor binding site suggesting that the HBG2:g-109G>T mutation has a functional role in increasing HBG2 transcription and is responsible for the HPFH phenotype observed in this case. d) One case of an adult compound heterozygote for nd-HPFH Cretan type in combination with β0-thalassemia (IVSI-1 GA) characterized by reduced HbA2 levels and elevated HbF levels than the ones observed in the presence of the Αγ -158 C>T mutation in heterozygosity with the majority of β-thalassemia mutations suggesting that the Αγ -158 C-->T Αγ mutation has a significant role in Aγ-globin gene transcription. A possible explanation for this difference might be the closer physical proximity of the Αγ-globin gene to the adult globin genes, compared to the Gγ-globin gene.e) it is the first published record of a compound heterozygote cases of HPFH/δβ-thalassemia. Genotypic analysis showed compound heterozygotes for Αγ-117GA mutation (nd-HPFH), and the Turkish type δβ-thalassemia, which is quite frequent in area of central Greece. HbF levels were considerably higher compared to typical Greek nd-HPFH and Turkish db-thalassemia heterozygotes and HbA2 levels were markedly reduced. Our data suggest that the interaction of nd-HPFH with db-thalassemia results in a clinical picture similar to db-thalassemia carriers, despite the markedly increased HbF levels.

Μελετήθηκαν οι cis-αλληλουχίες του γ-γονιδίου σφαιρίνης για την ταυτοποίηση μεταλλαγών υπεύθυνων για την παρουσία αυξημένης εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης σε ασθενείς με θαλασσαιμικά σύνδρομα [β-θαλασσαιμία, δβ-θαλασσαιμία και κληρονομική παραμονή εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HPFH)] με σκοπό την κατανόηση των μηχανισμών αλληλεπίδρασης έκφρασης των γονιδίων σφαιρίνης. Μελετήθηκαν 160 ασθενείς με β-θαλασσαιμία και αυξημένη HbF (52 άτομα), δβ-θαλασσαιμία (63άτομα), HPFH (30 άτομα). Τα αποτελέσματα είναι τα εξής:α) η κατανομή των θαλασσαιμικών μεταλλαγών στην περιοχή της Κεντρικής Ελλάδος είναι παρόμοια με της υπόλοιπης Ελλάδος. Η έλλειψη –MED του α γονιδίου σφαιρίνης και η έλλειψη/αναστροφή Τουρκικού τύπου αποτελούν τις πιο συχνές γενετικές αναδιατάξεις, ενώ η μετάλλαξη -101 (CT) του υποκινητή του β γονιδίου σφαιρίνης παρουσιάζει υψηλή συχνότητα στην κεντρική Ελλάδα.β) Περιγράφηκαν τρεις νέες περιπτώσεις γονιδιακής αναστροφής στην 5’ ρυθμιστική περιοχή των εμβρυϊκών γονιδίων σφαιρίνης. Οι αλλαγές αυτές αποτελούν μεταγραφικά σιωπηλούς πολυμορφισμούς που δε συμβάλλουν στην αύξηση των επιπέδων της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης υποδεικνύοντας ότι η 5' ρυθμιστική περιοχή των ανθρώπινων εμβρυϊκών γονιδίων σφαιρίνης είναι ένα ‘’hotspot’’ γονιδιακής αναστροφής που εμποδίζει τη μεγάλη ποικιλότητα της αλληλουχίας του υποκινητή των γονιδίων σφαιρίνης, υπογραμμίζοντας περαιτέρω την ανάγκη για δύο λειτουργικά εμβρυϊκά γονίδια σφαιρίνης στο στάδιο της εμβρυϊκής ερυθροποίησης.γ) περιγράφηκε ένας νέος τύπος nd-HPFH που οφείλεται σε μετάλλαξη στην περιοχή του υποκινητή του HBG2 γονιδίου (HBG2: g.-109G>T). Η μετάλλαξη αυτή, που βρίσκεται στο 3’ άκρο του δεύτερου CCAAT κουτί του γονιδίου HBG2, έχει ως αποτέλεσμα αυξημένα επίπεδα HbF και Gγ-σφαιρινικής αλυσίδας. Ηλεκτροφορητική ανάλυση μετατόπισης κινητικότητας έδειξε ότι η μετάλλαξη αυτή καταργεί μια θέση πρόσδεσης του NF-E3 μεταγραφικού παράγοντα. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι η HBG2: g-109G>T μετάλλαξη έχει λειτουργικό ρόλο ενισχύοντας τη μεταγραφή του HBG2 και είναι υπεύθυνη για το φαινότυπο HPFH.δ) μία περίπτωση διπλού ετεροζυγώτη για την nd-HPFH Κρητικού τύπου σε συνδυασμό με β0-θαλασσαιμία (IVSI-1 GA) με ελάχιστα επηρεασμένα αιματολογικούς δείκτες, συγκρινόμενα με αυτά του τυπικού ετεροζυγώτη για τη μεταλλαγή IVSI-1 και αυξημένα επίπεδα HbF. Η αύξηση της HbF είναι μεγαλύτερη από αυτή που παρατηρείται παρουσία της Αγ -158 C>T μεταλλαγής σε ετεροζυγωτία με την πλειονότητα των β-θαλασσαιμικών μεταλλαγών καταδεικνύοντας το λειτουργικό ρόλο της Αγ-158C>T μεταλλαγής στη μεταγραφή του Αγ-γονιδίου. ε) αναφέρεται για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία παράδειγμα διπλής ετεροζυγωτίας HPFH/δβ-θαλασσαιμίας. Πρόκειται για διπλούς ετεροζυγώτες για τη μεταλλαγή -117GA του Αγ-γονιδίου, υπεύθυνη για nd-HPFH, και τη δβ-θαλασσαιμία Τουρκικού τύπου που απαντάται συχνά στην Κεντρική Ελλάδα. Τα επίπεδα HbF ήταν σημαντικά υψηλότερα από τα αντίστοιχα των τυπικών ετεροζυγωτών για nd-HPFH και δβ-θαλασσαιμία, ενώ τα επίπεδα HbA2 ήταν σημαντικά μειωμένα. Βέβαια, τα αιματολογικά στοιχεία ήταν αντίστοιχα ενός τυπικού ετεροζυγώτη για δβ-θαλασσαιμία. Τα υψηλά επίπεδα της HbF δεν κατάφεραν να βελτιώσουν την αιματολογική εικόνα των διπλών ετεροζυγωτών nd-HPFH/δβ, συνεπώς, η συνύπαρξη nd-HPFH και δβ-θαλασσαιμίας οδηγεί σε κλινική εικόνα όμοια με αυτή των δβ-ετεροζυγωτών, παρά τα υψηλά επίπεδα της HbF.