Ανάπτυξη μη επεμβατικής προγεννητικής διαγνωστικής μεθόδου για την ανίχνευση της β-θαλασσαιμίας στον κυπριακό πληθυσμό

Abstract

β-thalassaemia is one of the commonest autosomal recessive single-gene disorders in Cyprus with about 14% of the population being carriers. Seven different beta-thalassaemia mutations account for over 98% of all cases with the mutation IVSI-110 representing the 79.8% of the total 7 different mutations. Prenatal diagnosis of β-thalassemia is mainly based on chorionic villus sampling done at the 11th week of gestation and amniocentesis done on the 15th week of gestation. Both procedures are invasive and pose an abortion risk to the fetus as well as psychological discomfort and distress.The recent discovery of cell free fetal DNA in the maternal circulation during pregnancy in combination with molecular techniques for the analysis of genetic markers has opened up new avenues for the non invasive prenatal diagnosis. Concerted effort was directed towards studying the presence of fetal genetic material in the maternal circulation and its use for a reliable and convenient non-invasive prenatal diagnosis. The fact that fetal DNA represents a minor population in maternal plasma comprising only up to 10% of free DNA, is highly fragmented and not a lot is known about the fetal DNA properties poses a technical challenge for the scientist making his detection difficult. The major aim of the present thesis is the development of a non invasive prenatal method for the diagnosis of β-thalassaemia with the detection of the paternally inherited alleles of the fetus in the maternal plasma of at risk pregnancies for β-thalassaemia. The approach is based on the analysis of SNPs located on the β-globin gene cluster. For the detection of the paternally inherited allele different techiniques have been investigated, such as AS-RTPCR, APEX microarrays/thalassochip and targeted next generation sequencing with the Illumina platform and PNA probes in combination with automated sequencing. For the determination of the most suitable approach for the isolation of fetal DNA in the plasma, a comparative parallel study has been performed with the Qiagen kits QIAamp DNA Blood Mini Kit and QIAamp DSP Virus kit. The later one gave the best results and therefore was used for the major part of this study. In subsequent studies the new Qiagen kit QIAamp circulating nucleic acid kit, was evaluated for its performance and it was shown to give even better results, therefore was used during the last part of this study.During the first stages of the study, the PCR method for the Y chromosome detection in the maternal plasma samples from male pregnancies was used for the confirmation of the presence of fetal material in the samples and as a tool for the standardization of the fetal detection in the maternal plasma during the process of the development of a NIPD method of β-thalassaeimia. Moreover, it was used as an internal control for the positive detection of fetal DNA. The identification of SNPs that will be used for the development of NIPD was performed as follows: For the determination of high heterozygote SNPs, genotyping analysis was performed on 75 random samples from the Greek Cypriot population on 140 SNPs located on the β-globin gene cluster. The SNPs with high heterozygosity were evaluated on 101 carrier couples for the determination of their suitability in NIPD. 49 SNPs with higher than 10% heterozygosity were therefore selected for their assessment as markers for NIPD of β-thalassaemia and for the determination of the number of families that will be benefited by NIPD by assigning the informative SNPs per family. The evaluation showed that 72.27% of the families have at least three informative SNPs, thus fulfilling the criteria for an accurate NIPD. One of the approaches that were used for the development of NIPD of β-thalassaemia was the Allele Specific Real Time PCR. The sensitivity and specificity of the method was determined for the SNP rs10837631 using genomic DNA where the minor allele was detected. The method was applied on maternal plasma samples for the same SNP where the expected detection of the paternally inherited allele was observed. However, the sensitivity of the approach was not the expected one therefore it was decided to abandon the method.The second method that was explored for the development of NIPD was the Arrayed Primer EXtension (APEX) assay, a microarray based assay that utilizes a chip called Thalassochip. Twenty one SNPs were selected to be placed on the thalassochip and evaluated for their suitability to be analyzed for NIPD. After the evaluation, the final thalssochip contained 18 SNPs. The sensitivity and specificity of the method was determined using genomic DNA. The method was applied on maternal plasma samples from mothers at risk for β-thalassaemia in their fetus. First, 34 maternal plasma samples were analyzed for 3 informative SNPs. It was observed that 79.3% gave the correct result while there was 1 false negative detection and 5 false positive detection of the paternally inherited allele. In a later stage, 10 families that had 2 to 6 informative SNPs were analyzed. From the results obtained, the paternal allele was succesfully detected in 18 cases out of 30 analyzed (60%). However, false negative detection was also observed in 5 (16.7%) cases and false potive detection in 7 (23.3%) cases. With the APEX approach, the paternally inherited allele was possible, presenting however, technical problems. Improvement of the method was not possible despite all the effort, therefore, it was decided to search for alternative approaches. In an attempt to identify efficient methodologies for the the maternal plasma analysis, alternative approaches were searched for the selective enrichment of the fetal allele, such as PNAs. The efficacy of PNAs was evaluated where the suppresion of the major allele and the enrichment of the minor allele was observed in one SNP while false positive detection was observed in the other SNP. However, the assessment of the optimal PNA concentration which needs to be established for each mutation per sample in combination with the high cost of the probe make the approach difficult to be applied for routine analysis and large scale clinical applications. Therefore, it was decided not to pursue the approach. The analytical power and the specificity of a modified version of NGS using the Illumina platform called ‘targeted sequencing’ was assessed for the development of NIPD. A preliminary study was done using 5 SNPs where the detection of the paternally inherited allele was achieved for 3 SNPs. Subsequently, the specificity of the platform to detect and differentiate the minor allele present in the overwhelming background of the maternal allele was confirmed using spiked genomic samples. The reliability of the method was assessed with the analysis of maternal plasma samples from 10 families having 3 to 4 informative SNPs. From 34 samples analysed, the paternal allele in the maternal plasma was positively detected and differentiated in 8 of the cases whereas in 18 cases no other measurable allele was observed (negative detection of the paternal allele). However, 4 false positive and 4 false negative results were also observed. Overall, the sequencing platform showed 81.8% specificity and 66.7% sensitivity with false positive rate 0.18% for the detection of the fetal allele in the maternal plasma. In conclusion, this study showed for the first time that the detection of the paternally inherited allele in the maternal plasma is possible with the targeted next generation sequencing with SNP analysis. Further studies are necessary for the improvement of the method and for the elimination of false positive and false negative results. To investigate the feasibility of SNPs for the NIPD of β-thalassaemia analysed by Illumina sequencing of the maternal plasma, haplotype analysis was performed. Haplotype analysis based on the results obtained was performed and NIPD was made for 7 out of 10 families. The importance of having a high number of SNPs for each family in order to eliminate the diagnostic error was illustrated in all cases.In summary, we reach the following conclusions:1.The importance of having a high number of SNPs for each family was highly illustrated in all methods used in this method. A higher number of multiple SNPs per sample analysed will improve the sensitivity and accuracy of NIPD and eliminate the diagnostic error. It was clearly demonstrated, therefore, that analysis on higher number of SNPs will markedly increase the statistical power to differentiate the maternal from the paternal allele through haplotype analysis with a higher level of accuracy and for a greater proportion of carrier couples.2.The detection of fetal alleles of paternal origin in the maternal plasma and NIPD was possible with the above methods. Sensitivity and specificity problems as well as false positives were observed that need substantial improvement. 3.Next Generation Sequencing shows the greatest accuracy and precision for the differentiation and detection of the fetal alleles of paternal origin and is currently the main technological platform used for the maternal plasma analysis for NIPD. 4.The detection of the paternally inherited allele applies only to the 50% of the cases where the fetus inherits the normal allele of the father. In the future, one should look for other approaches using this technology for deducing the maternally inherited allele as well with the use of an adapted method of the relative mutation dosage approach (RMD).Data derived from the present study can contribute towards an effective approach for the NIPD of β-thalassaemia. Directions for future development would be to improve the diagnostic efficiency, precision, accuracy and reliability of targeted next generation sequencing by eliminating the false positives and false negative results obtained by inclusion of a higher number of samples with more replicates. Using a higher number of multiple SNPs per sample analysed will improve the sensitivity and accuracy of NIPD.

Η β-θαλασσαιμία είναι μια από τις πιο κοινές κληρονομικές παθήσεις στην Κύπρο με ποσοστό φορέων που ανέρχεται στο 14% του πληθυσμού. Έχουν βρεθεί 7 διαφορετικές μεταλλάξεις της β-θαλασσαιμίας που αποτελούν το 98% των περιπτώσεων με τη μετάλλαξη IVSI-110 να είναι η πιο κοινή και αποτελεί το 79.8% του συνόλου. Για την προγεννητική διάγνωση της β-θαλασσαιμίας, χρησιμοποιείται κυρίως βιοψία του πλακούντα κατά την 11η εβδομάδα της κύησης ή αμνιοκέντιση στη 15η εβδομάδα. Οι δύο μέθοδοι είναι επεμβατικές και εμπεριέχουν περίπου 1-2% κίνδυνο για αυτόματη αποβολή του εμβρύου καθώς και ψυχολογική κόπωση και σωματική δυσφορία. Η πρόσφατη ανακάλυψη της παρουσίας εξωκυτταρικού ελεύθερου εμβρυϊκού γενετικού υλικού στην μητρική κυκλοφορία κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης σε συνδυασμό με την εφαρμογή των νέων μοριακών τεχνικών για την ανάλυση γονιδιωματικών δεικτών άνοιξε νέους ορίζοντες και οδήγησε πολλά ερευνητικά κέντρα στην μελέτη της παρουσίας αυτού του γενετικού υλικού κατά τη διάρκεια της κύησης και την χρησιμοποίησή του στην μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση. Το γεγονός ότι το εμβρυϊκό DNA στο μητρικό πλάσμα έχει πάρα πολύ μικρή συγκέντρωση, αποτελεί μέχρι 10% του συνολικού, ενώ μετρημένο με ψηφιακή PCR έχει βρεθεί να είναι μεγαλύτερο το ποσοστό, μέχρι και 20%, είναι θρυμματισμένο και κατακερματισμένο, και το ότι λίγα είναι γνωστά για το εμβρυϊκό DNA αποτελεί μία τεχνική πρόκληση και καθιστά δύσκολη την ανίχνευσή του. Ο βασικός σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη μη επεμβατικής προγεννητικής μεθόδου για τη διάγνωση της β-θαλασσαιμίας με την ανίχνευση των πατρικών κληρονομουμένων αλληλομόρφων που βρίσκονται στο εμβρυϊκό DNA το οποίο κυκλοφορεί στο μητρικό πλάσμα. Η προσέγγιση βασίζεται στην ανάλυση πολυμορφισμών που βρίσκονται στο σύμπλεγμα γονιδίων της β-σφαιρίνης. Για την ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου χρησιμοποιήθηκαν και αναλύθηκαν οι τεχνολογίες AS-RTPCR, μικροσυστοιχίες thalassochip/APEX, και στοχευμένη αλληλούχιση νέας γενιάς με την πλατφόρμα Illumina και δοκιμάστηκαν οι ανιχνευτές PNAs με αυτόματη αλληλούχιση. Για την εύρεση της καταλληλότερης μεθόδου για την απομόνωση του εμβρυϊκού DNA από το πλάσμα έγινε συγκριτική μελέτη μεταξύ των QIAamp DNA Blood Mini Kit και του QIAamp DSP Virus kit της Qiagen η οποία έδειξε ότι η QIAamp DSP Virus kit της Qiagen να είναι η βέλτιστη επιλογή και η οποία χρησιμοποιήθηκε κατά κύριο μέρος στην παρούσα μελέτη. Αργότερα αξιολογήθηκε η δυνατότητα του καινούριου kit από την Qiagen, το QIAamp circulating nucleic acid kit, συγκρίνοντας το παράλληλα με το QIAamp DSP Virus kit και αφού έδειξε ότι αποδίδει περισσότερο, επιλέχθηκε ως το κύριο kit απομόνωσης εμβρυϊκού DNA και χρησιμοποιήθηκε κατά τα τελευταία στάδια της παρούσας διατριβής. Στα αρχικά στάδια της μελέτης χρησιμοποιήθηκε η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης για το Y χρωμόσωμα σε δείγματα μητρικού πλάσματος με άρρεν έμβρυο για επιβεβαίωση ανίχνευσης εμβρυϊκού DNA, και ως ρύθμιση και τυποποίηση των συνθηκών για την ανίχνευση εμβρυϊκού DNA στο μητρικό πλάσμα στην προσπάθεια ανάπτυξης της μεθόδου για την διάγνωση της β-θαλασσαιμίας, αλλά και ως εσωτερικός μάρτυρας θετικής ανίχνευσης εμβρυϊκού DNA. Η εύρεση κατάλληλων πολυμορφισμών που θα χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη της ΜΕΠΔ έγινε ως εξής: Για την αναγνώριση πολυμορφισμών με υψηλή ετεροζυγωτία πραγματοποιήθηκε γονοτυπική ανάλυση 140 πολυμορφισμών που βρίσκονται στη συστάδα γονιδίων της β-σφαιρίνης σε 75 τυχαία δείγματα από τον ελληνικό πληθυσμό της Κύπρου. Η διαδικασία αυτή έγινε με τη μέθοδο της MALDI TOF Mass Array της Sequenom. Οι πολυμορφισμοί που παρουσίασαν ψηλό βαθμό ετεροζυγωτίας, αξιολογήθηκαν στη συνέχεια, σε 101 ζευγάρια φορείς για να καθοριστεί η καταλληλότητα τους για ΜΕΠΔ. 49 πολυμορφισμοί παρουσίασαν πάνω από 10% ετεροζυγωτία και ως εκ τούτου επιλέχθηκαν με σκοπό να εξεταστεί η καταλληλότητα και η δυναμική τους αξία ως δείκτες για ΜΕΠΔ β-θαλασσαιμίας και να προσδιοριστεί ο αριθμός των οικογενειών που επωφελούνται από αυτή, καθορίζοντας τους πληροφοριακούς πολυμορφισμούς ανά οικογένεια. Η αξιολόγηση αυτή έδειξε ότι 72.27% των ζευγαριών είχαν 3 πληροφοριακούς πολυμορφισμούς και πάνω και ως εκ τούτου κρίθηκαν κατάλληλα για ΜΕΠΔ. Μία από τις προσεγγίσεις που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη της ΜΕΠΔ της β-θαλασσαιμίας ήταν η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης πραγματικού χρόνου για ενίσχυση ειδικών αλληλομόρφων (AS-RTPCR). Η ευαισθησία και η ειδικότητα της μεθόδου εξετάστηκαν για τον πολυμορφισμό rs10837631 χρησιμοποιώντας γενωμικό DNA όπου ανιχνεύτηκε το αναμενόμενο έλασσον αλληλόμορφο. Η μέθοδος εφαρμόστηκε σε δείγματα μητρικού πλάσματος για τον πιο πάνω πολυμορφισμό όπου παρατηρήθηκε η αναμενόμενη ανίχνευση πατρικού κληρονομούμενου αλληλομόρφου. Λόγω της χαμηλής ευαισθησίας που παρουσίασε η μέθοδος όμως, αποφασίστηκε η μη συνέχισή της. Η δεύτερη μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη της ΜΕΠΔ ήταν η τεχονολογία των μικροσυστοιχιών και η ανάπτυξη του Τhalassochip, το οποίο βασίζεται στη μέθοδο της μονοβασικής επέκτασης του εκκινητή, APEX. Επιλέχθηκαν αρχικά 21 πολυμορφισμοί και οι οποίοι αξιολογήθηκαν για την καταλληλότητα τους για να τοποθετηθούν στο thalassochip και να αναλυθούν με τη μέθοδο APEX. Μετά την αξιολόγησή τους το τελικό thalassochip που προέκυψε περιέχει συνολικά 18 πολυμορφισμούς. Η μέθοδος εξετάστηκε ως προς την ευαισθησία και ειδικότητα της χρησιμοποιώντας γενωμικό DNA. Στη συνέχεια η μέθοδος εφαρμόστηκε σε δείγματα μητρικού πλάσματος από ζευγάρια φορείς με κίνδυνο θαλασσαιμικού εμβρύου. Σε πρώτη φάση αναλύθηκαν 34 δείγματα μητρικού πλάσματος σε 3 πολυμορφισμούς οι οποίοι ήταν πληροφοριακοί για τις επιλεγμένες οικογένειες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από την πρώτη φάση παρατηρήθηκε ότι ποσοστό 79.3%, έδωσαν το σωστό αποτέλεσμα ενώ παρατηρήθηκε ψευδή αρνητική ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου σε 1 δείγμα και ψευδής θετική ανίχνευση σε 5 δείγματα. Σε δεύτερη φάση αναλύθηκαν 10 οικογένειες οι οποίες είχαν από 2 μέχρι 6 πληροφοριακούς πολυμορφισμούς. Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν ανιχνεύθηκε με επιτυχία το πατρικό αλληλόμορφο σε 18 από τις 30 (60%) περιπτώσεις που αναλύθηκαν. Ωστόσο, παρατηρήθηκε ψευδής αρνητική ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου σε 5 (16.7%) περιπτώσεις, και ψευδής θετική ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου σε 7 (23.3%) περιπτώσεις. Με τη μέθοδο αυτή η ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου ήταν κατορθωτή, παρουσιάζοντας όμως αρκετά τεχνικά προβλήματα. Παρόλη την προσπάθεια που καταβλήθηκε να βελτιωθεί η μέθοδος, αυτό δεν έγινε δυνατό, οπότε δοκιμάστηκαν νέες τεχνολογιών.Προκειμένου να βελτιωθούν τα αποτελέσματα της ανάλυσης του μητρικού πλάσματος διερευνήθηκαν εναλλακτικές μέθοδοι για επιλεκτική ενίσχυση του εμβρυϊκού αλληλομόρφου όπως οι ανιχνευτές PNAs. Η αποδοτικότητα των PNAs αξιολογήθηκε κατά τις οποίες παρατηρήθηκε η καταστολή του μείζονος αλληλομόρφου και η επιλεκτική ενίσχυση του ελάσσονος στον ένα πολυμορφισμό ενώ για τον άλλο παρατηρήθηκε ψευδή ανίχνευση του άλλου αλληλομόρφου. Ωστόσο, η χρονοβόρα αξιολόγηση των ανιχνευτών PNA που είναι απαραίτητο να καθοριστεί για την κάθε μετάλλαξη/πολυμορφισμό και το κάθε υπό εξέταση δείγμα σε συνδυασμό με το υψηλό κόστος αγοράς τους καθιστούν την προσέγγιση αυτή όχι και τόσο ελκυστική. Ως εκ τούτου, αποφασίστηκε η μη συνέχιση αυτής της προσέγγισης. Στην συνέχεια της παρούσης μελέτης αξιολογήθηκε επίσης η εφαρμογή της στοχευμένης αλληλούχισης νέας γενιάς με την πλατφόρμα Illumina. Αρχικά έγινε μια προκαταρκτική μελέτη σε 5 πολυμορφισμούς όπου έγινε κατορθωτή η ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου στις περιπτώσεις που κληρονομήθηκε για τους 3 πολυμορφισμούς. Στη συνέχεια, καθορίστηκε η ειδικότητα της μεθόδου με την ανάλυση γενωμικού DNA. Η αξιοπιστία της μεθόδου αξιολογήθηκε με την ανάλυση μητρικού πλάσματος από 10 οικογένειες οι οποίες είχαν 3 μέχρι 4 πληροφοριακούς πολυμορφισμούς. Έγινε κατορθωτή η διαφοροποίηση και η ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου σε 8 περιπτώσεις, ενώ σε 18 περιπτώσεις δεν παρατηρήθηκε κανένα διαφορετικό αλληλόμορφο από αυτό της μητέρας που υποδηλώνει την αρνητική ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου. Ωστόσο, παρατηρήθηκαν 4 ψευδή αρνητικά αποτελέσματα και 4 ψευδή θετικά. Τα δεδομένα που προέκυψαν έδειξαν ότι η παρατηρούμενη διαγνωστική ευαισθησία και ειδικότητα της μεθόδου είναι 66.7% και 81.8% αντίστοιχα. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη έδειξε για πρώτη φορά ότι με τη μέθοδο της στοχευμένης αλληλούχισης και την ανάλυση των πολυμορφισμών είναι εφικτή η ανίχνευση του πατρικού κληρονομούμενου αλληλομόρφου. Περαιτέρω μελέτες είναι απαραίτητες για βελτίωση των ποσοστών αυτών και για απάλειψη των ψευδών θετικών. Στη συνέχεια, έγινε προσπάθεια να διαπιστωθεί αν είναι εφικτή η ΜΕΠΔ με την ανάλυση απλοτύπων από τα αποτελέσματα που προέκυψαν. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που προέκυψαν και με την ανάλυση απλοτύπων, ΜΕΠΔ πραγματοποιήθηκε σε 7 από τις 10 οικογένειες. Με την ανάλυση των απλοτύπων, τονίστηκε η αναγκαιότητα και σημασία του ψηλού αριθμού πολυμορφισμών για την κάθε οικογένεια ούτως ώστε να εκμηδενίζεται η πιθανότητα λάθους ΜΕΠΔ. Συνοψίζοντας, καταλήγουμε στα παρακάτω συμπεράσματα:1.Οι προσεγγίσεις που ακολουθήθηκαν στην παρούσα διατριβή και τα αποτελέσματα που προέκυψαν έδειξαν το σημαντικό ρόλο των πολυμορφισμών στη ΜΕΠΔ και την αναγκαιότητα ύπαρξης πολλών πληροφοριακών πολυμορφισμών για κάθε οικογένεια που ενδέχεται να αυξήσει το συνολικό ποσοστό της ευαισθησίας της ΜΕΠΔ και να εκμηδενίσει το ποσοστό σφάλματος. Με τη χρησιμοποίηση πολλαπλών πολυμορφισμών είναι εφικτή η ανάλυση των απλοτύπων για ΜΕΠΔ. 2.Η ανίχνευση εμβρυϊκών αλληλομόρφων πατρικής προέλευσης στο μητρικό πλάσμα και ΜΕΠΔ είναι δυνατή με διάφορες τεχνολογίες. Παρατηρήθηκαν όμως προβλήματα στην ευαισθησία και ειδικότητά τους που χρήζουν βελτίωσης. Αξιοσημείωτο συμπέρασμα που προέκυψε είναι η παρουσία των ψευδών θετικών. 3.Η Νέας Γενιάς Αλληλούχιση, ωστόσο, παρουσιάζει μεγαλύτερη ακρίβεια και αξιοπιστία στη διαφοροποίηση και ανίχνευση εμβρυϊκών αλληλομόρφων πατρικής προέλευσης και αποτελεί σήμερα την κύρια τεχνολογία ανάλυσης του μητρικού πλάσματος για τη ΜΕΠΔ στον επιστημονικό τομέα. 4.Η ανάλυση των πατρικών αλληλομόρφων στο μητρικό πλάσμα περιορίζεται μόνο στο 50% των κυήσεων, αυτών δηλαδή που φέρουν το φυσιολογικό αλληλόμορφο. Ωστόσο, αυτός ο περιορισμός μπορεί να ξεπεραστεί με τη χρησιμοποίηση προσέγγισης κατάλληλης για ανίχνευση του μητρικού αλληλομόρφου όπως την Ανάλογη Δοσολογία Μετάλλαξης (Relative Mutation Dosage-RMD).Τα δεδομένα που προκύπτουν από την παρούσα μελέτη μπορούν να συμβάλουν στην τυποποίηση αποτελεσματικής μεθοδολογίας μη επεμβατικής διάγνωσης για τη β-θαλασσαιμία. Εισηγήσεις για μελλοντική ανάπτυξη θα ήταν να βελτιωθεί η διαγνωστική αποτελεσματικότητα, ακρίβεια και αξιοπιστία της στοχευμένης νέας γενιάς αλληλούχισης με την εξάλειψη των ψευδών θετικών και ψευδών αρνητικών αποτελεσμάτων με τη χρησιμοποίηση περισσότερων δειγμάτων με περισσότερα αντίγραφα. Επίσης, χρησιμοποιώντας ένα μεγαλύτερο αριθμό πολλαπλών πολυμορφισμών ανά δείγμα προς ανάλυση, θα βελτιωθεί η ευαισθησία και η ακρίβεια της ΜΕΠΔ και θα εκμηδενιστεί η πιθανότητα διαγνωστικού λάθους.