Μελέτη της επίδρασης εξωγενών περιβαλλοντικών παραγόντων στα δίπτερα

Abstract

In order to study cell type-specifically impaired proteasome activities, in vitro developing D. melanogaster egg chambers were exposed to the MG132 or Epoxomicin proteasome inhibitors, while a GAL4/UAS binary genetic system was employed to generate double transgenic flies, overexpressing β2 and β6 -conditional- mutant proteasome subunits, as well as UBP2 ubiquitin protease or carrying, through an RNAi-mediated technology, downregulated the α5 subunit and the E2 ubiquitin-conjugated enzyme UbcD1. MG132 and Epoxomicin administration resulted in severe deregulation of in vitro developing egg chambers, which was associated with induction of nurse cell-specific apoptotic and autophagic death programs. In vivo targeted overexpression of β2 and β6 conditional mutants led to a notable upregulation of sporadic apoptosis potency, which justifies the observed reduction in eclosion efficiency. However, in response to intracellular abundance of UBP2, as well as of β2 and β6 conditional mutant forms and underrepresentation of α5 and UbcD1 proteasome determinants, a lethal phenotype was obtained at the third instar larval stage. Interestingly, using a similar genetic strategy of targeting in order to modify the expression levels of conditionally mutated β2 and β6 subunits, together with α5 and UBP2 proteins, their individualized functional importance in eye morphogenesis was undoubtedly evinced, with UBP2 overexpression resulting to an impressive “eyeless-like” phenotype. We also examined the effects of Bortezomib proteasome inhibitor in D. melanogaster. The obtained data reveal the fundamental role of proteasome activity in several physiological functions, with longevity and climbing dynamics being notably affected in a Dmp53-dependent manner. Having the capacity to induce caspase processing and activation, the drug results in a complete disruption of larva to pupa transition and deregulation of middle and late oogenesis, with the latter carrying novel apoptotic and autophagic phenotypes clearly generated by Dmp53-independent, and still elusive, molecular pathways. Moreover, we demonstrate the drug-induced activation of a coexisting apoptotic and autophagic program in the nurse cell cluster of the affected follicles, at developmental stages that have never been previously shown to exhibit any sign of degeneration. Finally, Dmp53 protein did not seem to be critically implicated in functions controlling larva to pupa transition, as well as middle and late oogenesis.

Στόχο της διατριβής αποτέλεσε η μελέτη της επίδρασης εξωγενών ουσιών που σχετίζονται με την ενεργοποίηση ή την καταστολή της λειτουργίας του πρωτεασώματος στο Δίπτερο έντομο D. melanogaster. Διαπιστώθηκε ότι καμία από τις ουσίες ενεργοποιητές του πρωτεασώματος δεν παρουσίαζε θετική επίδραση τόσο στη βιωσιμότητα, όσο και στην εκκολαψιμότητα των νυμφών σε τέλεια έντομα. Όσον αφορά στην επίδραση των αναστολέων, μελετήθηκε αρχικά ο αναστολέας του πρωτεασώματος Bortezomib τόσο σε έντομα αγρίου τύπου όσο και σε Dmp53-/-. Τα παρατηρηθέντα δεδομένα επιδεικνύουν την in vivo σημασία της ενεργότητας του πρωτεασώματος κατά τη διάρκεια κύριων βιολογικών διαδικασιών. Συγκεκριμένα, η ουσία Bortezomib μειώνει δραστικά το μέσο προσδόκιμο ζωής και την κινητική ικανότητα των εντόμων, με p53-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, αυξάνει στατιστικά σημαντικά το ποσοστό των ανωμάλων ωοθυλακίων στην ωογένεση και επάγει χαρακτηριστικά προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου σε τροφοκύτταρα ωοθυλακίων διαφορετικών αναπτυξιακών σταδίων από των αναμενόμενων φυσιολογικά. Τέλος διαπιστώθηκε ότι σταματά την ανάπτυξη των προνυμφών, εμποδίζοντας επομένως τη δημιουργία τέλειων εντόμων. Η δράση του αναστολέα Bortezomib κατά την ωογένεση, καθώς και κατά την ανάπτυξη των προνυμφών, δε φαίνεται να επηρεάζεται από το γονίδιο p53. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε in vitro ανάπτυξη ωοθυλακίων παρουσία των αναστολέων Epoxomicin και MG-132. Το πεπτίδιο Epoxomicin, διαπιστώθηκε ότι αναστέλλει την ανάπτυξη των ωοθυλακίων κατά 43%, ενώ η δράση του αναστολέα MG132 οδηγεί σε πλήρη αναστολή της ανάπτυξης των ωοθυλακίων, με τα τροφοκύτταρα τους να εμφανίζουν χαρακτηριστικά προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου και ενεργοποιημένη κασπάση Drice.Στη συνέχεια δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά στελέχη D. melanogaster, βασισμένα στην τεχνολογία GAL4/UAS. Σε διαγονιδιακά στελέχη με απενεργοποιημένη είτε την υπομονάδα β2, είτε τη β6 στα κύτταρα της γενετικής σειράς των ωοθυλακίων, παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στην εκκολαψιμότητα των εντόμων και αύξηση στο ποσοστό των ανωμάλων ωοθυλακίων. Σε διπλά διαγονιδιακά στελέχη με απενεργοποίηση, τόσο σε προνύμφες 3ου προνυμφικού σταδίου, όσο και σε οφθαλμικούς εμβρυϊκούς δίσκους, πρωτεασωμικών υπομονάδων και ρυθμιστικών πρωτεϊνών, παρατηρήθηκε διακοπή της ανάπτυξης των προνυμφών και επακόλουθος θάνατος στο συνολικό πληθυσμό των εντόμων. Ο οφθαλμός χαρακτηρίζεται από έντονο ανώμαλο φαινότυπο, με μη κανονική διάταξη σμηριγγών και μερική ή πλήρη έλλειψη ομματιδίων.