Μελέτη του ρόλου των 4-υδροξυλασών της προλίνης στην αύξηση και ανάπτυξη φυτών και καρπών τομάτας (Solanum lycopersicum)

Abstract

Prolyl 4-hydroxylases (P4Hs) hydroxylate peptidyl proline residues of plant cell wall glycoproteins. Collectively, hydroxyproline-rich glycoprotein (HRGPs) super-family consists of extensins, arabinogalactan proteins (AGPs) proline-rich proteins (PRPs) and lectins. Extensins and PRPs have primarily structural roles, but AGPs are molecules of particular interest since their structure, localization and physiological roles suggest that they function as diffused and/or anchored signals. The involvement of AGPs in almost all aspects of plant growth and development, makes necessary their study in an economically, nutritionally and biologically important model-plant such as tomato (Solanum lycopersicum). To this direction, the role of P4Hs and AGPs in plant growth was investigated as well as their involvement in fruit physiological processes. Inhibition of prolyl hydroxylation has been used as a tool for studying the role of HRGPs, since the oligosaccharides decorating their protein moiety partially determine their function. In the present dissertation, two experimental approaches were used for the inhibition of prolyl hydroxylation. Initially, the role of P4Hs in tomato seedling growth was investigated using the chemical inhibitor of P4H enzyme activity, 2,4-dicarboxylic acid (PDCA). Next, the role of one out of nine putative P4H tomato genes was investigated in plant growth, using the virus induced gene silencing (VIGS) technique. The results of both experimental approaches show that P4Hs have significant roles in plant growth, implicating in both cell expansion and cell division. Despite the involvement of AGPs in almost all aspects of plant growth and development, little is known about their role in climacteric fruit physiological processes. The significance of AGPs in tomato fruit ripening and in response to mechanical wounding, one of the most important postharvest stresses, was investigated. In this direction, the levels of the AGPs recognized by the monoclonal antibodies JIM8 and JIM13 were studied, as well as the expression profiles of the lysine-rich Le-AGP1 and the two classical AGPs, SlAGP1 and SlAGP2 during fruit ripening and in response of excised pericarp discs in mechanical wounding. Additionally, the effect of PDCA in fruit ripening and wounding response was investigated in excised pericarp discs. PDCA partially suppressed the wound-induced ethylene evolution as well as the climacteric ethylene production in ripening preclimacteric and climacteric pericarp discs. Collectively, these results show that AGPs and P4Hs have significant roles in fruit ripening and in response to mechanical wounding.

Οι υδροξυλάσες της προλίνης (prolyl 4-hydroxylases, P4Hs) υδροξυλιώνουν προλίνες πεπτιδικών αλυσίδων γλυκοπρωτεϊνών του κυτταρικού τοιχώματος των φυτών. Συνολικά οι γλυκοπρωτεΐνες πλούσιες σε υδροξυπρολίνη (Hydroxyproline-rich glycoproteins, HRGPs) αποτελούν μια υπερ-οικογένεια στην οποία ανήκουν οι εξτενσίνες, οι γλυκοπρωτεΐνες αραβινογαλακτάνης (arabinogalactan proteins, AGPs), οι πρωτεΐνες πλούσιες σε προλίνη (proline rich proteins, PRPs) και οι λεκτίνες. Οι εξτενσίνες και οι PRPs έχουν κυρίως δομικό ρόλο, αλλά οι AGPs παρουσίαζουν εξαιρετικό ενδιαφέρον καθώς η δομή, ο εντοπισμός και οι φυσιολογικές λειτουργίες που επιτελούν υποδηλώνουν ότι αποτελούν διάχυτα σήματα ή/και σήματα άγκυρας. Η συμμετοχή των AGPs σε σχεδόν όλες τις διαδικασίες αύξησης και ανάπτυξης των φυτών, καθιστά απαραίτητη τη μελέτη του ρόλου τους σε ένα οικονομικά, διατροφικά και βιολογικά σημαντικό μοντέλο-φυτό όπως η τομάτα (Solanum lycopersicum). Προς αυτή την κατεύθυνση, εξετάστηκε ο ρόλος των P4Hs και των AGPs στην αύξηση φυτών τομάτας και η συμμετοχή τους σε φυσιολογικές διεργασίες των καρπών. Η αναστολή της υδροξυλίωσης των προλινών αποτελεί εργαλείο για την μελέτη των HRGPs, καθώς οι ολιγοσακχαρίτες που συνδέονται με τον πρωτεϊνικό τους σκελετό, καθορίζουν εν μέρει την λειτουργία τους. Στην παρούσα διατριβή, για την αναστολή της υδροξυλίωσης των προλινών, χρησιμοποιήθηκαν δύο πειραματικές προσεγγίσεις. Αρχικά εξετάστηκε ο ρόλος των P4Hs στην αύξηση σπορόφυτων τομάτας, χρησιμοποιώντας τον χημικό αναστολέα της ενζυμικής δραστικότητας των P4Hs, 2,4 δικαρβοξυλικό οξύ της πυριδίνης (Pyridine 2,4-dicarboxylic acid, PDCA). Στη συνέχεια μελετήθηκε ο ρόλος ενός εκ των συνολικά εννέα υποθετικών γονιδίων P4Hs της τομάτας στην αύξηση των φυτών, μέσω της τεχνικής της ιικά επαγώμενης γονιδιακής σίγησης (Virus Induced Gene Silencing, VIGS). Τα αποτελέσματα και των δύο προσεγγίσεων δείχνουν ότι οι P4Hs παίζουν σημαντικό ρόλο στην αύξηση των φυτών, συμμετέχοντας τόσο στην αύξηση όσο και στη διαίρεση των κυττάρων. Παρά τη συμμετοχή των AGPs σε σχεδόν όλες τις αναπτυξιακές διαδικασίες των φυτών, δεν είναι γνωστός ο ρόλος τους στις φυσιολογικές διεργασίες των κλιμακτηρικών καρπών. Διερευνήθηκε ο ρόλος των AGPs στην διαδικασία ωρίμανσης καρπών τομάτας και της απόκρισης τους σε μηχανικό τραυματισμό, που αποτελεί μια από τις σημαντικότερες μετασυλλεκτικές καταπονήσεις. Προς αυτή την κατεύθυνση, μελετήθηκαν τα επίπεδα των AGPs που αναγνωρίζονται από τα μονοκλωνικά αντισώματα JIM8 και JIM13 καθώς και η έκφραση του πλούσιου σε λυσίνη Le-AGP1 και των δύο κλασσικών AGPs, SlAGP1 και SlAGP2 στην ωρίμανση των καρπών και την απόκριση δισκίων περικαρπίου σε μηχανικό τραυματισμό. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση του αναστολέα των P4Hs, PDCA, στην ωρίμανση και απόκριση των καρπών σε μηχανικό τραυματισμό, χρησιμοποιώντας δισκία που αφαιρέθηκαν από το περικάρπιο καρπών. Το PDCA μείωσε την παραγωγή αιθυλενίου που εκλύεται εξαιτίας του μηχανικού τραυματισμού, καθώς και την παραγωγή του κλιμακτιρικού αιθυλενίου που παράγεται κατά την ωρίμανση προκλιμακτιρικών και κλιμακτιρικών δισκίων περικαρπίου. Συνολικά, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι AGPs και οι P4Hs παίζουν σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση των καρπών και την απόκριση τους σε μηχανικό τραυματισμό.