Μελέτη της λειτουργίας της πρωτεΐνης της ντομάτας LeRpt5 (LeMA-1 Lycopersicon esculentum Mg-dependent ATPase-1), σε φυτά

Abstract

Tomato protein LeMA-1 is a member of a new family of Mg-dependent ATPases called AAA protein family, and specifically member of the subgroup of the regulatory particle triple A ATPases (Rpts) of the 26S protease complex. The protein is located in the nucleus and is expressed in all plant tissues examined (tomato). This work is the first report of an in vivo study of one of these proteins in whole organism (apart from yeast). The code region of LeMA-1 was cloned onto the genome of the Potato virus X PVX) and the construct was used to inoculate plants (tomato, Nic. Benthamiana and Nic. Clevelandi). The plants that were infected with virus carrying LeMA-1 sequences developed a lethal phenotype with characteristic symptoms: growth arrest, epinasty of shoots and distortion of the newly emerging leaves, which 15 days post infection lead to plant death. Constructs carrying the whole coding sequences as well as those carrying different deletion fragments of LeMA-1, both exhibited the same sequence of events after infection. Viruses trigger RNA silencing in infected plants (VIGS virus induced gene silencing). When they carry endogenous sequences then the insert –the endogenous gene- is attacked by RNA silencing as well, which in the case of LeMA-1 caused the observed lethal phenotype. Based on these results it was estimated that this tool could be applied to study the phenotype caused by the expression of the other Rpts via PVX. For this purpose, parts of the coding sequences of four Rpts of tomato (the clones were obtained from a sequence bank) were cloned onto PVX and the constructs were used to inoculate plants. Of these, the PVX-Rpt1 construct was infectious and caused a lethal phenotype, with symptoms less severe than the ones observed with the LeMA-1 constructs. The Rpt1 plants were arrested, the symptoms affected the newly emerging leaves which were distorted as well as the shoots but to a lesser extend compared with the LeMA-1 phenotype.

Η LeMA-1 είναι πρωτεΐνη της ντοµάτας που ανήκει σε µια νέα οµάδα Mg-εξαρτώµενων ΑΤΡασών, τις ΑΑΑ πρωτεΐνες, και ειδικά στην υποοικογένεια των ρυθµιστικών ΑΤΡασών της 26S πρωτεάσης (Rpts, ανασκόπηση Patel & Latterich 1998). Η πρωτεΐνη εντοπίζεται σε πυρήνες καθώς και σε όλους τους ιστούς του φυτού (ντοµάτα) που εξετάσθηκαν. Στην εργασία αυτή παρουσιάζεται για πρώτη φορά µελέτη της συµπεριφοράς µιας πρωτείνης της οµάδας αυτής, in vivo, σε ολόκληρο ευκαρυωτικό οργανισµό. Η κωδική περιοχή της πρωτεΐνης κλωνοποιήθηκε στο γένωµα του ιού της πατάτας Χ (PVX), και εκφράστηκε σε φυτά που µολύνθηκαν µε την κατασκευή αυτή (ντοµατιές, Nic. Benthamiana και Nic. Clevelandi). Οι ανασυνδυασµένοι ιοί που έφεραν την πλήρη ή και διάφορα τµήµατα της κωδικής περιοχής της LeMA-1 προκάλεσαν θνησιγόνο φαινότυπο µε χαρακτηριστικά συµπτώµατα, ίδια και στα τρία είδη φυτών που χρησιµοποιήθηκαν, τα οποία είναι πολύ εντονότερα στα νέα φύλλα: αναστολή της ανάπτυξης του φυτού, χαρακτηριστική επιναστία βλαστών και φύλλων (καρούλιασµα), συρρίκνωση των νεύρων και των ελασµάτων και παραµόρφωση των φύλλων. Η παρουσία του ιού στο κύτταρο προκάλεσε την έναρξη του φαινοµένου της γονιδιακής σίγησης µέσω ιών (VIGS) το οποίο εκτός από τις ιικές ακολουθίες επηρεάζει και το RNA της LeMA-1 που περιέχεται στο γένωµα του ιού σαν ένθεση και πιθανό το ενδογενώς παραγόµενο RNA της πρωτεΐνης µε συνέπεια την εµφάνιση του χαρακτηριστικού θνησιγόνου φαινοτύπου στα φυτά. Με βάση τα αποτελέσµατα από την έκφραση της LeMA-1 σε φυτά, θεωρήθηκε σκόπιµο να µελετηθεί και η συµπεριφορά των άλλων πέντε ΑΑΑ ΑΤΡασών της ντοµάτας της υποοικογένειας των Rpts, µε τις οποίες η LeMA-1 έχει αναφερθεί να σχηµατίζει εξαµελή δακτύλιο, µέρος του συµπλόκου της 26S πρωτεάσης. Τµήµατα της κωδικής περιοχής των πρωτεϊνών αυτών της ντοµάτας (Rpt1, 2, 3, 4, και 6) κλωνοποιήθηκαν στον PVX και οι κατασκευές διοχετεύθηκαν σε φυτά. Από αυτές τις κατασκευές επιτυχής ήταν η µόλυνση µε την PVX-Rpt1, η οποία προκάλεσε επίσης θνησιγόνο φαινότυπο µε ηπιότερα συµπτώµατα από εκείνα που παρατηρήθηκαν µε τις κατασκευές της LeMA-1: το φυτό παρουσιάζει επίσης αναστολή της ανάπτυξης και ηπιότερη παραµόρφωση των νέων φύλλων και βλαστών.