Απομόνωση και ανάλυση γονιδίων της οικογένειας HSP90 στο είδος Mytilus galloprovincialis (Lamark, 1819)

Abstract

The commercially important marine bivalve Mytilus galloprovincialis (Mediterranean mussel) is considered a valuable bioindicator, due to its exposure to various pollutants and extreme environmental conditions. Environmental responsive genes, such as the hsp90s, protect the structure and function of cells and accomplish a significant task in cellular homeostasis. The highly conserved HSP90 protein family is involved in various cellular processes, through cooperation mainly with members of the HSP70 family, as well as other chaperones, and is related to several autoimmune diseases, various infections and cancer. Recent studies focused on members of the HSP70 gene family from M. galloprovincialis. However, few data concerning the HSP90 family in Mollusca are available. Apart from the few cDNA sequences isolated from some Bivalvia and Gasteropoda, no data is available for the genomic organization and copy number of the hsp90 genes in Mollusca, the second largest metazoan phylum. To study the hsp90s in M. galloprovincialis a genomic library was screened, using a homologous probe isolated by PCR. Primers were designed using multiple alignments of various Hsp90 protein sequences. Five clones were isolated and were divided into two groups, according to mapping with restriction endonucleases and Southern hybridizations. One representative clone from each group was further analysed and two hsp90s with the same genomic organization were isolated. Sequence analysis revealed that the two genes contain nine exons and exhibit great similarities in both the 5΄ non-coding and the coding region but differ in the 3΄ non-coding region, as well as in three introns, due to the presence of repeated sequences. The 5΄ non-coding region of both genes contains a non-translated exon and multiple binding sites for various transcription factors, which indicates a putative interaction of these factors and thus a complex gene regulation. The existence of multiple HSEs points towards a high inducibility of the genes, yet we cannot rule out the possibility that these genes are also constitutively expressed. Few synonymous substitutions in the coding region of the copies result to an identical predicted polypeptide, which belongs to the cytoplasmic (CYT) HSP90 subfamily, whose size is in accordance with the size of an Hsp90 peptide detected in two M. galloprovincialis tissues in various temperatures. The functionality of the isolated hsp90s is further substantiated by the identification of highly similar ESTs from this species. The repeated sequences identified within the hsp90s’ introns are putative transposable elements, showing structural similarity to transposable elements previously characterised in other Bivalves (Pearl). One of the currently isolated Mytilus elements is already characterized (Mg9), while the three newly identified in the current study are named Mg4, Mg6 and Mg8. The existence of repeated elements within hsp90 introns has never been reported so far, and their role in the expression and evolution of these genes should be further analysed. Analysis of large sized introns containing repeated elements could be applied in the discrimination of populations or species of the genus Mytilus. Isolation and characterization of similar transposable elements from other molluscan representatives could aid in the investigation of the phylogenetic relationships within and outside the phylum. It is possible that purifying selection may be responsible for the sequence homogenization of M. galloprovincialis hsp90 genes. However, due to the lack of genomic data from closely related organisms, we cannot rule out the possibility that the isolated genes are the result of recent gene duplication. Data from closely related organisms are required in order to determine the time this duplication event took place. As shown by the comparative analysis, HSP90 family members underwent multiple duplications and also subsequent losses during their evolution. Εven in unicellular organisms their organization and thus their regulation is quite complicated. In multicellular organisms, there are multiple binding sites for various transcription factors, which may indicate a more complicated interaction of these factors during gene regulation, and as a response to different stimuli, developmental stages, or tissue in which the genes will be expressed. Results from our phylogenetic analysis are in general concordance with previous studies, yet there are differences as to the topology within invertebrates. Our results support the monophyly of Mollusca, Bivalvia, Gastropoda and Cephalopoda. The current study suggests that Hsp90s could prove a useful tool for the study of intra- and inter phylogenetic relationships of Mollusca. The presence of a p53 binding site in the promoter of the isolated genes raises questions about the possible implication of hsp90s in molluscan leukemia. Further investigation will reveal the putative way in which p53 regulates the expression of hsp90s, as well as the utility of M. galloprovincialis as a model organism in the study of molluscan leukemia and leukemia in other animals in general. Finally, the characterized M. galloprovincialis hsp90 sequences add to the currently available knowledge on the stress-response system of a species that survives under extreme environmental conditions and could reinforce previous attempts (Dondero et al. 2006) concerning the use of mussel genes for biological monitoring purposes.

Το εμπορικής αξίας θαλάσσιο δίθυρο Mytilus galloprovincialis (Mediterranean mussel) θεωρείται ένας σημαντικός βιοδείκτης, λόγω της έκθεσής του σε ποικίλους ρυπογόνους παράγοντες και ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες. Γονίδια των οποίων η έκφραση είναι άμεσα εξαρτώμενη από το περιβάλλον, όπως τα γονίδια hsp90s, προστατεύουν τη δομή και λειτουργία του κυττάρου και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ομοιόστασή του. Τα μέλη της υψηλά συντηρημένης οικογένειας HSP90 εμπλέκονται σε ποικίλες κυτταρικές διεργασίες, μέσω συνεργασίας με μέλη της οικογένειας HSP70, καθώς και άλλες σαπερόνες, και σχετίζονται με αυτοάνοσα νοσήματα, μολύνσεις και καρκίνο. Πρόσφατες μελέτες έχουν εστιαστεί σε μέλη της γονιδιακής οικογένειας HSP70 από το M. galloprovincialis. Ωστόσο, ελάχιστα δεδομένα είναι διαθέσιμα όσον αφορά στην οικογένεια HSP90 στα Μαλάκια και περιορίζονται σε μικρό αριθμό cDNA αλληλουχιών από Δίθυρα και Γαστερόποδα. Συνεπώς, δεν υπάρχουν πληροφορίες σχετικά με την γονιδιωματική οργάνωση και τον αριθμό αντιγράφων των hsp90 στα Μαλάκια, το δεύτερο μεγαλύτερο σε αριθμό μελών φύλο στα Μετάζωα. Για τη μελέτη των γονιδίων hsp90 στο M. galloprovincialis σαρώθηκε μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη με ομόλογο ανιχνευτή, που ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που σχεδιάστηκαν σε συντηρημένα τμήματα πρωτεϊνικών αλληλουχιών Hsp90. Απομονώθηκαν συνολικά πέντε γονιδιωματικοί κλώνοι, οι οποίοι κατανεμήθηκαν σε δύο ομάδες, με βάση τη χαρτογράφηση με ενδονουκλεάσες περιορισμού και τους υβριδισμούς κατά Southern. Η περαιτέρω ανάλυση ενός αντιπροσωπευτικού κλώνου από κάθε ομάδα φανέρωσε την παρουσία δύο γονιδίων hsp90s με παρόμοια γονιδιωματική οργάνωση. Τα δύο γονίδια αποτελούνται από εννέα εξόνια, εμφανίζουν ομοιότητα στην 5΄ μη μεταφραζόμενη περιοχή και στην κωδικοποιούσα περιοχή, αλλά διαφέρουν σημαντικά στην 3΄ μη μεταφραζόμενη περιοχή (UTR), καθώς και σε τρία ιντρόνια, λόγω της παρουσίας επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών. Η 5' ρυθμιστική περιοχή και στα δύο γονίδια περιλαμβάνει ένα μη μεταφραζόμενο εξόνιο καθώς και πολλαπλές θέσεις δέσμευσης για μεταγραφικούς παράγοντες, γεγονός που υποδεικνύει την πιθανή αλληλεπίδραση των παραγόντων αυτών και επομένως την πολύπλοκη ρύθμιση των γονιδίων. Τα δύο γονίδια είναι πιθανότατα ισχυρά θερμοεπαγόμενα, λόγω της ύπαρξης πολλών HSEs, αν και δεν αποκλείεται και η συστατική τους έκφραση. Οι ελάχιστες συνώνυμες αντικαταστάσεις στην κωδικοποιούσα περιοχή των δύο αντιγράφων οδηγεί στην παραγωγή ενός μοναδικού πεπτιδίου με κυτταροπλασματικό εντοπισμό, το μέγεθος του οποίου είναι σε συμφωνία με το Hsp90 πεπτίδιο που εντοπίστηκε σε 2 ιστούς του M. galloprovincialis σε διαφορετικές θερμοκρασίες. Η λειτουργικότητα των γονιδίων που απομονώθηκαν επιβεβαιώνεται, επιπρόσθετα, και από την ανίχνευση όμοιων ESTs του είδους. Οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες που εντοπίστηκαν μέσα στα ιντρόνια των γονιδίων hsp90 είναι πιθανά μεταθετά στοιχεία με δομική ομολογία προς μεταθετά στοιχεία που έχουν χαρακτηριστεί σε άλλα δίθυρα (Pearl). Ένα από τα απομονωμένα στοιχεία είναι ήδη χαρακτηρισμένο (Mg9), ενώ τρία νέα αναγνωρίστηκαν στην παρούσα μελέτη και ονομάστηκαν Mg4, Mg6 και Mg8. Η παρουσία επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών στο εσωτερικό ιντρονίων hsp90 γονιδίων δεν έχει αναφερθεί ως τώρα σε άλλα είδη και ο ρόλος τους στην έκφραση κι εξέλιξη των γονιδίων αυτών χρήζει περαιτέρω μελέτης. Η ανάλυση ιντρονίων με μεγάλο μέγεθος κι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (δορυφορικές αλληλουχίες, μεταθετά στοιχεία) θα μπορούσε πιθανά να εφαρμοστεί στη διάκριση ειδών και πληθυσμών Mytilus, σύμφωνα με την ως τώρα εμπειρία από άλλα είδη. Η απομόνωση και ανάλυση παρόμοιων αλληλουχιών από άλλα αντιπροσωπευτικά είδη του φύλου των Μαλακίων θα μπορούσε να βοηθήσει στη διευκρίνιση των φυλογενετικών σχέσεων εντός και εκτός φύλου. Η υψηλή ομοιότητα των δυο αντιγράφων μπορεί να οφείλεται σε φυσιολογικοποιούσα επιλογή (purifying selection) που ομογενοποιεί τις δύο αλληλουχίες. Ωστόσο, δεν μπορεί να αποκλειστεί η πιθανότητα τα δύο γονίδια να είναι το αποτέλεσμα ενός πρόσφατου γονιδιακού διπλασιασμού. Απαιτούνται όμως επιπρόσθετα δεδομένα από στενά συγγενικούς οργανισμούς, ώστε να καθοριστεί η ακριβής χρονική στιγμή που έλαβε χώρα ο διπλασιασμός αυτός. Όπως φαίνεται και από τη συγκριτική ανάλυση, τα μέλη της γονιδιακής οικογένειας HSP90 υπέστησαν πολλαπλούς διπλασιασμούς και πιθανώς και απώλειες στη διάρκεια της εξέλιξης τους. Φαίνεται ακόμα πως ακόμα και σε μονοκύτταρους οργανισμούς η οργάνωση και κατά συνέπεια η ρύθμιση των γονιδίων είναι αρκετά πολύπλοκη. Στους πολυκύτταρους οργανισμούς αυξάνονται οι θέσεις δέσμευσης για διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες, γεγονός που υποδηλώνει μια πιο πολύπλοκη αλληλεπίδραση κατά τη ρύθμιση των γονιδίων ανάλογα με το ερέθισμα, το εξελικτικό στάδιο ή τον ιστό στον οποίο θα εκφραστούν τα εν λόγω γονίδια. Τα αποτελέσματα της φυλογενετικής ανάλυσης, που πραγματοποιήθηκε στην παρούσα εργασία, συμφωνούν σε γενικές γραμμές με προηγούμενες μελέτες, ωστόσο διαφοροποιούνται ως προς την τοπολογία μέσα στα ασπόνδυλα. Τα αποτελέσματα μας υποστηρίζουν τη μονοφυλετική προέλευση των Μαλακίων, των Δίθυρων, των Γαστερόποδων και των Κεφαλόποδων. Η οικογένεια HSP90 φαίνεται ότι μπορεί να αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων εντός των Μαλακίων, καθώς και των σχέσεων του φύλου με άλλα φύλα των ευκαρυωτών. Η παρουσία μιας θέσης δέσμευσης για τον παράγοντα p53 στην 5' UTR εγείρει ερωτήματα για την πιθανή εμπλοκή των hsp90s στη λευχαιμία των Μαλακίων. Περαιτέρω διερεύνηση απαιτείται για τον τρόπο με τον οποίο η p53 ρυθμίζει την έκφραση των γονίδιων hsp90, καθώς και για τη χρησιμότητα του M. galloprovincialis ως οργανισμού-μοντέλο για τη μελέτη της λευχαιμίας στα Μαλάκια ειδικά και σε ζωικούς οργανισμούς γενικότερα. Οι αλληλουχίες hsp90 που χαρακτηρίστηκαν στην παρούσα μελέτη εμπλουτίζουν τα μέχρι σήμερα γνωστά δεδομένα γύρω από το σύστημα απόκρισης σε πλήγμα ενός είδους που ζει κάτω από ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με προηγούμενες μελέτες (Dondero et al. 2006) για σκοπούς βιοπαρακολούθησης.