Αμιδοϋδρολάση των λιπαρών οξέων και άλλα συστατικά του ενδοκανναβινοειδούς συστήματος στην tetrahymena: μελέτη της έκκρισης του ενζύμου

Abstract

In the present study, we investigated the two main enzymes of the endocannabinoid system Fatty Acid Amide Hydrolase, FAAH and Μonoacylglycerol lipase, MAGL in the ciliate Tetrahymena thermophila. The main substrates of these enzymes are considered to be anandamide, ΑΕΑ for FAAH and 2-acylglycerols, 2-arachidonoylglycerol (2-AG) και 2- oleoylglycerol (2-OG) for MAGL, but also FAAH. In previous studies we showed that FAAH is present in Tetrahymena pyriformis and its secretion has been reported. In this study we found that Tetrahymena thermophila is also able to metabolize AEA by the action of FAAH. The activity was present in cell homogenate and all subcellular fractions and it was enriched almost three times in the membrane fraction, suggesting that FAAH is mainly a membrane bound enzyme, with evidence for the existance of a cytosolic form. Using specific FAAH inhibitors (URB597 and AM374), the activity was significantly decreased (~30-50% and ~85% respectively), and the IC50 was found 70 nM for URB597 and 20 nΜ for AM374. Using Tetrahymena thermophila cell homogenate, we found that 2-AG, as well as 2-OG, were hydrolyzed to glycerol and the respective fatty acid, by the action of two enzymes, FAAH and a MAGL. MAGL activity was found in Tetrahymena for the first time. 2-AG was a better substrate compared to 2-OG and was used to further characterize MAGL in the presence of FAAH inhibitor, URB597. Our results showed that 2-AG was metabolized in a time and protein concentration dependent manner. MAGL activity was maximal at pH 8-9 with an apparent KM of 14,1μΜ and Vmax of 5,8 nmol/min×mg. Subcellular fractionation of cell homogenate showed that MAGL activity was present in the membrane and cytosolic fractions (optimum pH ~7-8 and ~7 respectively), suggesting the presence of two types of MAGL. This finding was confirmed by immunoblot analysis; the presence of an immunoreactive protein with a molecular mass of ~45 kDa was revealed in all fractions and an additional band of ~40 kDa in the cytosolic fraction. As already mentioned, 2-acylglycerols are good substrates for FAAH also. In the presence of specific FAAH inhibitors such us URB597 and AM374, the hydrolysis of 2-OG was inhibited by ~30% and ~45% maximum with an IC50 of 19 nM and 2,7 nM respectively. These results suggest that ~40% of 2-OG metabolism was due to FAAH in Tetrahymena thermophila cell homogenate. The cytosolic form of FAAH appears to contribute more in 2-AG hydrolysis in comparison to the membrane bound enzyme. 186 To provide additional conclusive evidence for the existence of MAGL in Tetrahymena, DNA was isolated and standard PCR reaction, using three pairs of primers, was performed targeting three different potential MAGL genes. PCR produced only one band per gene in the expected molecular weight and PCR products sequencing revealed a single protein of the hydrolase family of Tetrahymena per gene for the two hits and one hypothetical protein for the other. The secretion of both enzymes, FAAH and MAGL, in starvation medium was also investigated. We found that both enzymes are rabidly secreted in the medium, and the activity, for FAAH, depends on the time the cells remain in the medium. FAAH activity, in AEA hydrolysis, seems to be eliminated after 60 min in the starvation medium, in contrast to MAGL activity, using 2-OG as substrate, which appears to be stable after 180 min in the starvation medium. FAAH also contributes in 2-OG hydrolysis. Interestingly, FAAH’s contribution appears to begin only 60 min after cells remain in the starvation medium, with ~40% contribution in 2-OG hydrolysis, suggesting the presence of two types of FAAH. Proteomic analysis of both homogenate and supernatant revealed the presence of 202 and 135 protein spots respectively and MALTI –TOF analysis identified 88 proteins for the homogenate and 41 for the supernatant, where 14 of the identified proteins were common for both samples. In conclusion, MAG Lipase, the enzyme responsible for 2-acylglycerol hydrolysis, was identified and characterized for the first time in Tetrahymena. It was also found that FAAH, the enzyme responsible for AEA hydrolysis, contributes in 2-acylglycerol hydrolysis. The presence of these molecules in protists suggests the importance of the endocannabinoid system throughout the evolution.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν τα κύρια καταβολικά ένζυμα του ενδοκανναβινοειδούς συστήματος, η αμιδοϋδρολάση των λιπαρών οξέων (Fatty Acid Amide Hydrolase, FAAH) και η λιπάση των μονοακυλογλυκερολών (Μonoacylglycerol lipase, MAGL) στο πρωτόζωο Tetrahymena thermophila. Τα κύρια υποστρώματα των παραπάνω ενζύμων, είναι τα ενδοκανναβινοειδή ανανταμίδιο (ΑΕΑ) για το ένζυμο της FAAH και οι 2-ακυλογλυκερόλες, 2- αραχιδονυλογλυκερόλη (2-AG) και 2-ελαϋλογλυκερόλη (2-OG) κυρίως για το ένζυμο της MAGL, αλλά και για τη FAAH. Στη μελέτη διαπιστώθηκε ότι και η Tetrahymena thermophila μπορεί να υδρολύσει το ΑΕΑ, με τη δράση του ενζύμου της FAAH. Η δραστικότητα ήταν παρούσα στο ομογενοποίημα, καθώς και σε όλα τα υποκυτταρικά κλάσματα και εμπλουτίστηκε σχεδόν τρεις φορές στο μεμβρανικό, αποδεικνύοντας ότι πρόκειται για ένα κυρίως μεμβρανικό ένζυμο, με σημαντικές ενδείξεις ύπαρξης και διαλυτής μορφής αυτού. Χρησιμοποιώντας ειδικούς αναστολείς ως προς το ένζυμο της FAAH, όπως είναι ο URB597 και ο AM374, η υδρόλυση του ΑΕΑ μειώθηκε σημαντικά (~30-50% χρησιμοποιώντας τον URB597 και ~85% τον AM374), και τα IC50 βρέθηκαν ίσα με 70 nM για τον URB597 και 20 nΜ για τον AM374. Χρησιμοποιώντας το ομογενοποίημα της Tetrahymena thermophila, βρέθηκε ότι η 2-AG, όπως και η 2-OG, υδρολύθηκαν προς γλυκερόλη και το αντίστοιχο λιπαρό οξύ, από τη δράση δυο ενζύμων, της FAAH και της MAGL. Σημειώνεται ότι με την παρούσα μελέτη διαπιστώνεται για πρώτη φορά η ύπαρξη δραστικότητας MAGL στην Tetrahymena και γενικότερα σε κατώτερους μονοκύτταρους οργανισμούς. Η 2-AG ήταν καλύτερο υπόστρωμα για τη MAGL και για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε και για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό του ενζύμου στο ομογενοποίημα των κυττάρων, παρουσία του ειδικού αναστολέα της FAAH, URB597. Από τα αποτελέσματα φαίνεται ότι η υδρόλυση της 2-AG εξαρτάται από τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης, από το χρόνο της αντίδρασης, τη θερμοκρασία και έχει βέλτιστο pΗ 8-9. Κινητική μελέτη της αντίδρασης έδειξε ότι η υδρόλυση ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten, με φαινόμενο KΜ = 14,1 μΜ και Vmax = 5,8 nmol/min×mg πρωτεΐνης. Υποκυτταρική κλασμάτωση του ομογενοποιήματος έδειξε την παρουσία τόσο κυτοσολικής όσο και μεμβρανικής μορφής της MAGL (βέλτιστο pH ~7 and ~7-8 αντίστοιχα), υποδεικνύοντας την παρουσία δυο μορφών MAGL στα κύτταρα. Η παραπάνω υπόθεση επιβεβαιώθηκε με πειράματα ανοσοαποτύπωσης, τα οποία αποκάλυψαν μια 184 ανοσοδραστική ζώνη στα ~45 kDa σε όλα τα υποκυτταρικά κλάσματα και μια επιπλέον ζώνη στα ~40 kDa στο κυτοσολικό κλάσμα. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι 2-ακυλογλυκερόλες είναι υποστρώματα και για το ένζυμο της FAAH. Έτσι, παρουσία των ειδικών αναστολέων της FAAH, URB597 και AM374, η υδρόλυση της 2-OG ανεστάλει ~30% και ~45% αντίστοιχα, και τα IC50 βρέθηκαν ίσα με 19 nM and 2,7 nM αντιστοίχως. Αυτά τα αποτελέσματα μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι ~40% της υδρόλυσης των 2-ακυλογλυκερολών οφείλεται στη δράση της FAAH. Ταυτόχρονα παρατηρούμε ότι η κυτοσολική μορφή του ενζύμου συνεισφέρει σε μεγαλύτερο βαθμό στην υδρόλυση σε σχέση με τη μεμβρανική. Για την περαιτέρω απόδειξη της ύπαρξης του ενζύμου της MAGL στην Tetrahymena, απομονώθηκε DNA και χρησιμοποιώντας την αντίδραση της PCR και τρία ζευγάρια εκκινητών, καταφέραμε να απομονώσουμε τρία πιθανά γονίδια έκφρασης του ενζύμου. Η αλληλούχιση των προϊόντων της αντίδρασης της PCR αποκάλυψε δυο πρωτεΐνες της οικογένειας των υδρολασών και μια υποθετική πρωτεΐνη. Παράλληλα, μελετήθηκε η έκκριση και των δυο ενζύμων, της FAAH και της MAGL, σε μέσο ασιτίας. Και τα δυο ένζυμα φαίνεται να εκκρίνονται ταχύτητα στο μέσο, έκκριση η οποία εξαρτάται, για το ένζυμο της FAAH, από το χρόνο παραμονής των κυττάρων στο μέσο. Η έκκριση της FAAH και η υδρόλυση του ΑΕΑ από το εκκρινόμενο ένζυμο, φαίνεται να σταματάει μετά από 60 λεπτά παραμονής στο μέσο, σε αντίθεση με την υδρόλυση της 2-OG, η οποία φαίνεται να αυξάνεται μέχρι και τα 180 λεπτά. Η συμμετοχή της MAGL στην υδρόλυση της 2- OG παραμένει πρακτικά σταθερή και στα 180 λεπτά. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η συμμετοχή της FAAH στην υδρόλυση της 2-OG, η οποία ξεκινά μετά την πάροδο των 60 λεπτών και είναι υπεύθυνη για το ~40% της υδρόλυσης της 2-OG, γεγονός που μας οδηγεί στο συμπέρασμα ύπαρξης τουλάχιστον δυο μορφών FAAH. Πρωτεωμική ανάλυση του ομογενοποιήματος και του μέσου ασιτίας των κυττάρων στην έκκριση, έδωσε 202 και 135 πρωτεϊνικές κηλίδες αντίστοιχα και με ανάλυση αυτών με την τεχνική MALTI–TOF, ταυτοποιήθηκαν 88 πρωτεΐνες από το ομογενοποίημα και 41 από το μέσο ασιτίας, με τις 14 από αυτές να είναι κοινές. Συμπερασματικά, διαπιστώθηκε για πρώτη φορά η παρουσία και ταυτοποιήθηκε MAGL στην Tetrahymena, ένζυμο υπεύθυνο για την υδρόλυση των 2-ακυλογλυκερολών. (ιαπιστώθηκε επίσης ότι η FAAH, το ένζυμο υπεύθυνο για την υδρόλυση του ΑΕΑ, συμμετέχει και στην υδρόλυση των 2-ακυλογλυκερολών. Η παρουσία αυτών των μορίων στα πρώτιστα αποδεικνύει τη μεγάλη σημασία του ενδοκανναβινοειδούς συστήματος δια μέσου της εξέλιξης των οργανισμών