Μελέτη του ρόλου της κασπάσης 8 κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, διαφοροποίησης και λειτουργίας των Τ λεμφοκυττάρων χρησιμοποιώντας in vitro συστήματα και την τεχνολογία των διαγονιδιακών ποντικών

Abstract

Within the framework of this PhD thesis, mechanisms that are involved in the activation, differentiation and function of T lymphocytes have been studied. Specifically, the role of components of the pro-inflammatory tumor necrosis factor (TNF) signaling pathway (TNF receptor I and caspase 8) in regulating incoming TCR-mediated signals to shape effector T cell responses in vitro and in vivo have been investigated. The TNF/TNFRI signaling pathway, in which caspase 8 is involved, is a major activator of NF-κB which is essential for T cell activation. NF-κB deficiency results in attenuation of immune responses and diminished IL-2 production by T cells. TNF- and TNF receptor I (TNFRI)-deficient mice are resistant to initiation and show delayed resolution of disease in paradigms of autoimmune disease such as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and collagen-induced arthritis (CIA). Available knowledge shows that TNF/TNFRI signalling plays a significant role in advancing both the initiation and the resolution of autoimmune diseases. However, the contribution of TNF/TNFRI signaling to T-cell activation and effector responses has not yet been determined. Recent findings show that caspase 8, an apical caspase in apoptosis signaling, also plays an essential role in T cell activation. Following TCR engagement, caspase 8 nucleates a complex with BCL10 and MALT1, which then binds TRAF6 and relocates to T cell lipid rafts. This results in NF-κB activation which is essential for the development of proper immune responses and differential induction of gene expression in T cells. In humans, individuals that carry mutations in the caspase 8 gene show defective T cell, B cell and NK cell activation, and develop an immunodeficiency syndrome. Since a body of mechanistic data now exists to show that NF-κB mediates the effect of caspase 8 in T cells, this study is focused on the investigation of TNFRI/NF-κB signaling pathway in TCR mediated T cell activation, both in vivo and in vitro using CD3+-enriched primary T cells and mice deficient in TNFRI. We show that following TCR engagement, TNFRI KO T cells showed significantly delayed proliferation, cell division, upregulation of interleukin 2 (IL-2) and IL-2 receptor a chain (CD25) mRNA and cell-surface expression of CD25 compared to WT cells. Interestingly, TNFRI KO mice developed defective primary T-cell responses. Effector T cell maturation as measured by cytokine production following TCR stimulation, was similarly delayed in TNFRI KO cells with cytokine production being initially delayed but later increased compared to WT control cells. Further, it seems that TNFRI-mediated cytokine regulation might involve a T-cell autonomous effect. Our results show a novel role for TNFRI as a positive T-cell costimulatory molecule that is important for timely T-cell activation, effector cytokine production and the development of primary immune responses in mice.

Η διατριβή αυτή επικεντρώνεται στη μελέτη των μηχανισμών που διέπουν την ενεργοποίηση, τη διαφοροποίηση και τη λειτουργία των Τ λεμφοκυττάρων κατά τη διάρκεια των ανοσολογικών αποκρίσεων. Πιο συγκεκριμένα, μελετάται η συμβολή και η εμπλοκή του μεταγωγού μονοπατιού σήματος του υποδοχέα 1 του TNF (TNFRI) και της κασπάσης 8 στο μεταγωγό μονοπάτι σήματος του υποδοχέα των Τ λεμφοκυττάρων (T cell receptor - TCR). Το μεταγωγό μονοπάτι σήματος του TNF/TNFRI, στο οποίο συμμετέχει και η κασπάση 8, είναι ένα από τα κύρια μονοπάτια τα οποία οδηγούν στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB. Ο NF-κΒ είναι απαραίτητος για την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, καθώς έχει δειχθεί ότι η απενεργοποίησή του οδηγεί σε μειωμένες ανοσολογικές αποκκρίσεις και σημαντικά μειωμένη παραγωγή της ιντερλευκίνης 2. Ποντίκια με απενεργοποιημένο το γονίδιο του TNF ή του TNFRI εμφανίζουν καθυστερημένη έναρξη εκδήλωσης συμπτωμάτων αυτοάνοσων ασθενειών (όπως είναι η πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα - ΕΑΕ - και η επαγόμενη από το κολλαγόνο αρθρίτιδα - CIA) όπως επίσης και χειρότερη κλινική εικόνα κατά τη χρόνια φάση των ασθενειών σε σύγκριση με τα φυσιολογικού τύπου ποντίκια. Αυτό δείχνει ότι το μεταγωγό μονοπάτι σήματος του TNF/TNFRI είναι θεμελιώδους σημασίας για την έναρξη αλλά και πορεία των νόσων αυτών. Ωστόσο, η συνεισφορά του μονοπατιού αυτού στην ενεργοποίηση και τις ανοσολογικές αποκρίσεις των δραστικών Τ λεμφοκυττάρων δεν έχει καθοριστεί πλήρως. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η κασπάση 8, μια εναρκτήριος κασπάση των αποπτωτικών μονοπατιών, παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων. Κατόπιν ενεργοποίησης του Τ υποδοχέα η κασπάση 8 δημιουργεί σύμπλοκο με τα μόρια BCL10 και MALT1 συνεισφέροντας, με τη βοήθεια του μορίου TRAF6, στη στρατολόγησή τους στις λιπιδικές σχεδίες των Τ λεμφοκυττάρων. Αυτό οδηγεί στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB που είναι απαραίτητος για τις σωστές ανοσολογικές αποκρίσεις και τη διαφοροποιημένη γονιδιακή έκφραση των Τ λεμφοκυττάρων. Έχει βρεθεί ότι μεταλλάξεις του γονιδίου της κασπάσης 8 σε ανθρώπους προκαλούν μειωμένη ενεργοποίηση των Τ και Β λεμφοκυττάρων όπως και των φυσικών κυττάρων φονιάδων, και ως εκ τούτου οδηγούν σε ανοσολογική ανεπάρκεια. ..................