Πολυμορφικοί δείκτες και χρωμοσωμικές θραύσεις στην καρκινογένεση

Abstract

Introduction. Recent studies have implicated the DNA damage response pathway in the earliest stages of carcinogenesis. It appears that fragile sites may be particularly vulnerable (for example, FRA3B, FRA9E, FRA11C) leading us and others to hypothesize that they may be preferentially targeted even in early lesions. Methods. The experimental material, human and mouse genomic DNA, was derived from two experimental models of carcinogenesis: human skin xenografts that were grown with the addition of exogenous growth factors and urothelial hyperplasia from transgenic mice overexpressing the RAS gene. The development of the material recapitulates the pathological course of preneoplastic lesions and represents its earliest stages with accuracy. In addition, we also analysed DNA from U2OS cells that were grown under replication stress, induced by the overexpression of the CDT1 gene. We employed state-of-the-art DNA microarray technology (Affymetrix SNP and Nimblegen aCGH) in order to evaluate at once up to 10204 positions on the human genome and 385000 positions on the mouse genome. The juxtaposition of normal and abnormal counterparts enabled us to precisely locate genomic lesions, especially loss-of-heterozygosity (hemizygous deletion). We analyzed the human genome project release 36.1, including the assembled chromosomes and the corresponding annotation which were obtained from NCBI. Based on a previous, well known algorithm (FLEX-STAB software, first presented by Mishmar et al, 1999), we devised and implemented a novel method to study the structural characteristics of DNA sequences. Using Repeat Masker we estimated the presence of repetitive DNA within normal and fragile regions. In total, we analysed approximately 2.5 billion bases, divided into 56 common fragile sites (aphidicolin type) and 1913 non-fragile chromosome bands. Results and conclusions. The percentage of LOH was 13.53% (28 of 189 SNPs) in fragile sites and 9.4% in non-fragile sites (logistic regression, p = 0.04). Out of 44 fragile sites that contained at least one informative marker, 12 (27.3%) had LOH in one or more SNP. The fragile sites were found to be, on average, less flexible (mean twist angle 10.742, compared with 10.787, p = 0.045). At the same time, the average GC content was higher in fragiles sites (41.7%, compared with 40.8% in normal regions, p = 0.03). In contrast with other reports, we did not find an increased percentage of retro-transposon sequences (LINE1, LINE2) within the fragile sites. As a matter of fact, their percentage appeared to be lower in fragile sequences (15.67% versus 16.82%), but the difference was not statistically significant (p = 0.055). On the other hand, we found an increased presence of SINE sequences, especially Alu, with a mean percentage of 11.66% inside the fragile sites and 10.65% in non-fragile sites (p = 0.009).

Εισαγωγή. Σε πρόσφατες δημοσιεύσεις διαπιστώθηκε η ενεργοποίηση του μηχανισμού απάντησης στη γενωμική βλάβη από τα πλέον πρώιμα στάδια της καρκινογένεσης. Παράλληλα, παρατηρήθηκε η ευπάθεια ορισμένων εύθραυστων θέσεων (FRA3B, FRA9E, FRA11C) και διατυπώθηκε η υπόθεση ότι οι θέσεις αυτές είναι ευάλωτες ακόμα και σε πρώιμες αλλοιώσεις όπως είναι η υπερπλασία και η δυσπλασία. Μέθοδοι. Το πειραματικό υλικό προήλθε από δύο πειραματικά μοντέλα: ξενομοσχεύματα ανθρώπινου δέρματος που αναπτύχθηκαν υπό την επίδραση αυξητικών παραγόντων και υπερπλαστικό ουροθήλιο διαγονιδιακών ποντικών που υπερεκφράζαν το γονίδιο RAS. Το υλικό προσομοιάζει, παθολογοανατομικά, σε πρώιμες προκαρκινικές αλλοιώσεις αλλά δεν έχει δεχθεί ανεξέλεκγτες επιδράσεις. Επιπλέον, αναλύσαμε το γένωμα κυττάρων U2OS που αναπτύχθηκαν υπό την επίδραση αντιγραφικού στρες από υπερέκφραση του γονιδίου CDT1. Χρησιμοποιήσαμε την τεχνολογία των μικροσυστοιχιών DNA (Affymetrix microarray SNP, Nimblegen aCGH) για να αξιολογήσουμε ταυτόχρονα έως και 10204 θέσεις πάνω στο ανθρώπινο γένωμα και 385000 θέσεις πάνω στο γένωμα του ποντικού. Η αντιπαράθεση του φυσιολογικού και του παθολογικού δείγματος επιτρέπει τον ακριβή εντοπισμό των γενωμικών βλαβών, ιδιαίτερα της απώλειας ετεροζυγωτίας (ημίζυγη διαγραφή). Αναλύσαμε τη χαρτογράφηση 36.1 του γενώματος από το NCBI μαζί με την διαθέσιμη αλληλουχία. Βελτιώσαμε και αναπτύξαμε μια μέθοδο μελέτης των δομικών γνωρισμάτων της αλληλουχίας του DNA βασιζόμενοι στο γνωστό πρόγραμμα FLEX-STAB. Μελετήσαμε επίσης την παρουσία επαναλαμβανόμενου DNA στις φυσιολογικές και στις εύθραυστες θέσεις. Συνολικά αναλύσαμε περίπου 2.5 δισεκατομμύρια βάσεις σε 56 κοινές εύθραυστες θέσεις τύπου αφιδικολίνης και σε 1913 μη εύθραυστες χρωμοσωμικές μπάντες. Αποτελέσματα και συμπεράσματα. Στις εύθραυστες θέσεις το ποσοστό της απώλειας ετεροζυγωτίας ήταν 13.53% (28 από 189 δείκτες) ενώ στις μη εύθραυστες θέσεις ήταν 9.4% (logistic regression, p = 0.04). Από τις 44 εύθραυστες θέσεις που περιείχαν τουλάχιστον ένα πληροφοριακό πολυμορφικό δείκτη, οι 12 (27.3%) παρουσίαζαν απώλεια ετεροζυγωτίας σε έναν ή περισσότερους δείκτες. Οι εύθραυστες θέσεις ήταν κατά μέσον όρο περισσότερο δύσκαμπτες (γωνία στρέψης 10.742 σε αντίθεση με 10.787, p = 0.045). Παράλληλα, διαπιστώσαμε αυξημένο ποσοστό GC εντός των εύθραυστων θέσεων (41.7% σε σχέση με 40.8%, p = 0.03). Σε αντίθεση με ορισμένα μεμονωμένα βιβλιογραφικά ευρήματα, δεν διαπιστώσαμε αυξημένη παρουσία ρετροτρανσποζονίων μεγάλου μήκους (LINE1, LINE2) εντός των εύθραυστων θέσεων. Για την ακρίβεια, το ποσοστό ήταν οριακά χαμηλότερο (15.67% σε σχέση με 16.82%, για τις LINE1), αλλά η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0.055). Αντίθετα, διαπιστώσαμε αυξημένη παρουσία αλληλουχιών SINE και ειδικότερα Alu, με ποσοστό 11.66% στις εύθραυστες θέσεις και 10.65% στις μη εύθραυστες (p = 0.009).