Μελέτη της διαφοροποίησης του νευρικού συστήματος χρησιμοποιώντας ως μοντέλο εμβρυονικά βλαστοκύτταρα

Abstract

The generation of neural stem cells with posterior character is a very attractive venue for cell replacement therapies. Many protocols have been described that generate neural stem cells (NSCs) from embryonic stem cells (ESCs) that have by default an anterior identity. Here we describe a system which results in the generation of NSCs with specific posterior identity. Using two successive knock-ins and appropriate transgenes of the Tet- On system we have established mouse ESC lines that allow inducible expression of Hoxb1. We have shown that we can inducibly express Hoxb1 at any point during differentiation. We have analyzed the effects of its inducible expression during the neuroepithelial expansion phase, the progenitor and final differentiation phase in order to understand its impact on cell cycle progression, neuronal progenitor specification and terminal differentiation. Induction of Hoxb1 transgene expression forces NSCs to acquire a specific posterior hindbrain identity evident by the repression of anterior neural marker expression and the activation of a specific hindbrain genetic programme. At this stage the endogenous Hoxb1 autoregulatory loop is activated which results in changes in the expression of DV signaling pathways as well as changes in the relative distribution of the expression of DV progenitor markers. Taken together these data provide for the first time strong evidence that Hox transcription factors have a direct impact on DV specification of neuronal progenitors. We also compared the growth characteristics and cell cycle progression of Hoxb1+ and Hoxb1- NSCs at the stage of terminal differentiation. After mitogen withdrawal Hoxb1+ cells keep proliferating and become transient amplifying progenitors instead of terminally differentiating. This is due at least partially to Hoxb1 dependent activation of the Notch signalling pathway. Thus we have successfully separated the NSC and progenitor state of these cells. Affymetrix gene expression profiling has confirmed and extended these observations providing at the same time their molecular underpinnings. This analysis has provided testable hypotheses concerning molecules and pathways that may be involved in the expansion of posterior NSCs. Thus we have used engineered ESCs to generate NSCs with a posterior identity and shown that these cells have a distinct character. We anticipate that this approach will be of general applicability to establish NSC lines with distinct posterior identities that will lead to improved therapeutic applications.

Ενας εξαιρετικά μεγάλος αριθμός νευρικών κυττάρων με διαφορετικές ιδιότητες και λειτουργίες δημιουργείται κατά την διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Τα τελευταία χρόνια υπήρξε αλματώδης πρόοδος στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που δημιουργούν αυτήν την πολυτυπία. Η χρήση αυτής της γνώσης στην κατευθυνόμενη διαφοροποίηση εμβρυονικών βλαστοκυττάρων (ΕΒΚ) αποτελεί μια ελκυστική οδό για την in vitro δημιουργία νευρικών υποτύπων. Πολλά πρωτόκολλα έχουν περιγραφεί για την in vitro δημιουργία νευρικών βλαστοκυττάρων (ΝΒΚ) από ΕΒΚ. Ωστόσο τα κύτταρα αυτά υιοθετούν πρόσθια ταυτότητα. Στην εργασία αυτή περιγράφουμε ένα σύστημα το οποίο οδηγεί στη δημιουργία ΝΒΚ συγκεκριμένης οπίσθιας ταυτότητας. Χρησιμοποιώντας δύο διαδοχικές γονιδιακές υποκαταστάσεις με διαγονίδια του συστήματος της επαγώγιμης γονιδιακής έκφρασης Tet-On δημιουργήσαμε ΕΒΚ που επιτρέπουν επαγώγιμη έκφραση του Hoxb1, ενός ομοιοκυτικού μεταγραφικού παράγοντα που παίζει πρωταρχικό ρόλο στην διαφοροποίηση ενός τμήματος του οπίσθιου εγκεφάλου. Μπορούμε να επάγουμε την έκφραση του Hoxb1 σε οποιοδήποτε σημείο κατά την διάρκεια της διαφοροποίησης. Αναλύουμε τα αποτελέσματα της έκφρασης του κατά τον πολλαπλασιασμό των νευρικών προδρόμων και κατά την τελική διαφοροποίησή τους προκειμένου να κατανοήσουμε τον ρόλο του στην προώθηση του κυτταρικού κύκλου, τον προσδιορισμό των νευρικών προδρόμων και την τελική νευρική διαφοροποίηση. Η επαγωγή της έκφρασης του διαγονιδίου Hoxb1 οδηγεί στη δημιουργία ΝΒΚ με οπίσθια ταυτότητα, στην ενεργοποίηση ενός οπίσθιου γενετικού προγράμματος και την καταστολή των πρόσθιων γενετικών προγραμμάτων. Στο στάδιο αυτό έχουμε την κινητοποίηση του ενδογενούς βρόγχου θετικής αυτορρύθμισης του ενδογενούς γονιδίου Hoxb1 που οδηγεί σε αλλαγές στην έκφραση των παραγόντων των ΡΚ σηματοδοτικών μονοπατιών αλλά και σε αλλαγές στην έκφραση των ΡΚ μοριακών δεικτών. Η εργασία αυτή δείχνει για πρώτη φορά την αλληλεπίδραση των μεταγραφικών παραγόντων Hox με τα ΡΚ σηματοδοτικά μονοπάτια. Επίσης συγκρίναμε τον πολλαπλασιασμό των Hoxb1+ και τον Hoxb1- νευρικών προδρόμων στο στάδιο της τελικής διαφοροποίησης. Μετά την αφαίρεση του μιτογόνου bFGF τα Hoxb1+ κύτταρα συνέχισαν να πολλαπλασιάζονται και υιοθέτησαν χαρακτήρα παροδικά πολλαπλασιαζόμενων πρόδρομων κυττάρων αντί να διαφοροποιηθούν σε νευρώνες. Αυτό οφείλεται κατά ένα μέρος στην διατήρηση ενεργού του σηματοδοτικού μονοπατιού Notch από το Hoxb1. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων των μικροσυστοιχιών επιβεβαίωσε τις παραπάνω παρατηρήσεις και θα είναι χρήσιμη για x i την εύρεση μορίων και σηματοδοτικών μονοπατιών που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των οπίσθιων ΝΒΚ. Η σημαντικότητα των αποτελεσμάτων μας έγκειται στο γεγονός ότι η ενεργοποίηση ενός μόνο Hox γονιδίου ήταν επαρκής ώστε να ενεργοποιηθεί ένα γενετικό πρόγραμμα μιας συγκεκριμένης ΠΟ ταυτότητας. Στη μελέτη αυτή, για πρώτη φορά περιγράφεται η δημιουργία ΝΒΚ οπίσθιου χαρακτήρα από ΕΒΚ χωρίς την χρήση εξωγενών σημάτων που επάγουν ανομοιογένεια, όπως του ρετινοϊκού οξέος. Πέρα από το βασικό ενδιαφέρον αυτών των μελετών, ανοίγεται η προοπτική in vitro δημιουργίας προδρομων κυττάρων και ακολούθως νευρικών κυττάρων συγκεκριμένης ΠΟ ταυτότητας χρήσιμων για φαρμακολογικές μελέτες αλλά και για μεταμοσχεύσεις