Διερεύνηση του ρόλου του συστήματος CD40, προ-φλεγμονωδών και φλεγμονωδών κυτοκινών στην ανάπτυξη χαμηλού βαθμού φλεγμονής σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 1

Abstract

Type 1 Diabetes is characterized by low grade inflammation, which is confirmed by high levels of inflammatory markers such as C-reactive protein (CRP) in diabetic patients and seems to be linked to the initiation and development of disease’s complications such as cardiovascular disease and diabetic nephropathy. CD40, a transmembrane receptor of the tumor necrosis factor (TNF) gene superfamily is expressed on a variety of cells, such as monocytes, B-cells, antigen presenting cells, endothelial, smooth muscle cells and fibroblasts and implicated in chronic inflammatory and autoimmune diseases, such as type 1 Diabetes. The aim of this thesis was: 1) to determine the regulation of CD40 in transcriptional, translational and post-translational level and its association with parameters such as diabetes duration, metabolic control, glycosylated hemoglobin (HbA1c) etc., so as to define the pathophysiological relationship between CD40 and low-grade diabetic inflammation 2) To assess the nature of diabetic inflammation and the involvement of specific mediators in this, by determining a large number of inflammatory and anti-inflammatory cytokines and their correlation with CD40. 3) To study possible changes in the levels of cytokines between patients with diabetes duration of 0-6 months (period of remission of the disease) and those with diabetes duration longer than 6 months (period of established disease), in order to identify which of them probably mediates the destruction of the remaining b-cells, which still exist at the time of diagnosis. Plasma, urine and peripheral blood mononuclear cells from 70 type 1 diabetic patients without established complications and from 40 healthy controls were used for the experiments. The latter included techniques such as ELISA, Western blot, RTPCR, endonuclease digestion, sequencing and protein arrays, in order to determine a) the levels of soluble CD40 in plasma and urine of diabetic patients and healthy controls, b) the quantity of cellular CD40 and the pattern and relative amount of CD40 mRNA isoforms in peripheral blood mononuclear cells and c) the concentrations of IL-1a, IL-1b, IL -2, IL -4, IL -5, IL -6, IL -8, IL -10, IL -12, IL -13, GM-CSF, GRO, IFN-c, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, RANTES, TNF-a, MMP-9, VEGF in plasma of diabetic patients and healthy controls. The conclusions of this work are summarized as follows: 21 1) Hyperglycaemia affects the transcriptional and translational control of CD40 system both in vivo and in vitro, since CD40 levels were elevated in plasma, urine and cells of diabetic patients and associated with glycosylated haemoglobin and also increased secretion of CD40 was observed in culture supernatants of peripheral blood mononuclear cells under conditions of hyperglycaemia. Furthermore a strong positive correlation was found between poor glycemic control of patients and the absence of CD40-isoform, which has an inhibitory role in the progress of inflammatory processes. Therefore, the homeostatic dysregulation of CD40 system under conditions of hyperglycaemia is implicated in the establishment of an increased inflammatory activity in the body, which contributes to the initiation and progress of type 1 diabetic complications

Ο Σακχαρώδης Διαβήτης Τύπου 1 χαρακτηρίζεται από χαμηλού βαθμού φλεγμονή, που επιβεβαιώνεται από υψηλά κυκλοφορούντα επίπεδα φλεγμονωδών δεικτών όπως η C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) και φαίνεται να συνδέεται με την έναρξη και εξέλιξη των επιπλοκών της νόσου όπως η καρδιαγγειακή νόσος και η διαβητική νεφροπάθεια. Το CD40 είναι ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας της γονιδιακής υπεροικογένειας του παράγοντα νέκρωσης όγκων (TNF) που εκφράζεται σε μία πληθώρα κυττάρων μεταξύ των οποίων μονοκύτταρα, Β-λεμφοκύτταρα, αντιγονοπαρουσιαστικά, ενδοθηλιακά, λεία μυικά κύτταρα και ινοβλάστες και εμπλέκεται σε χρόνιες φλεγμονώδεις και αυτοάνοσες ασθένειες όπως ο Σακχαρώδης Διαβήτης τύπου 1 . Σκοπός της Διατριβής αυτής ήταν: 1) να προσδιοριστεί η ρύθμιση του CD40 σε μεταγραφικό, μεταφραστικό και μετα-μεταφραστικό επίπεδο και να συσχετιστεί με παράγοντες όπως η διάρκεια Διαβήτη , ο μεταβολικός έλεγχος, η γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη (HbΑ1c) κ.ά. προκειμένου να βρεθεί η αιτιοπαθογενετική του σχέση με τη χαμηλού βαθμού φλεγμονή στο Σακχαρώδη Διαβήτη τύπου 1. 2) Να αποτιμηθεί η φύση της διαβητικής φλεγμονής και η συμμετοχή διαφόρων παραγόντων σε αυτήν, μέσω του προσδιορισμού ενός μεγάλου αριθμού φλεγμονωδών και αντι- φλεγμονωδών κυτοκινών και της συσχέτισής του με το CD40. 3) Να μελετηθούν πιθανές μεταβολές στα επίπεδα των κυτοκινών μεταξύ ασθενών με διάρκεια διαβήτη 0-6 μήνες (περίοδος ύφεσης της νόσου) και αυτών με διάρκεια διαβήτη μεγαλύτερη των 6 μηνών (περίοδος εγκατεστημένης νόσου), ώστε να εντοπιστεί πιθανή συμμετοχή κάποιων από τα μόρια αυτά στην τελική καταστροφή των β-κυττάρων που έχουν απομείνει κατά τη διάγνωση. Χρησιμοποιήθηκαν βιολογικά υλικά όπως πλάσμα, ούρα και μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος από 70 ασθενείς με Διαβήτη τύπου 1 χωρίς εγκατεστημένες επιπλοκές και από 40 υγιείς μάρτυρες. Τα πειράματα συμπεριελάμβαναν τεχνικές όπως ELISA, Western blot, RT-PCR, endonuclease digestion, sequencing και protein arrays, προκειμένου να προσδιοριστούν τα επίπεδα του διαλυτού CD40 στο πλάσμα και τα ούρα των διαβητικών ασθενών και των υγιών μαρτύρων, το κυτταρικό CD40, το πρότυπο και η σχετική ποσότητα των mRNA ισομορφών του σε μονοπύρηνα του περιφερικού αίματος και τέλος οι συγκεντρώσεις των IL-1α, IL -1b, IL -2, IL -4, IL - 5, IL -6, IL -8, IL -10, IL -12, IL -13, GM-CSF, GRO, IFN-γ, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, 19 RANTES, TNF-α, MMP-9, VEGF στο πλάσμα των διαβητικών ασθενών και των υγιών μαρτύρων. Τα συμπεράσματα της εργασίας αυτής συνοψίζονται ως εξής: 1) Η υπεργλυκαιμία επηρεάζει τον μεταγραφικό και μεταφραστικό έλεγχο του συστήματος του CD40 τόσο in vivo όσο και in vitro, καθώς τα επίπεδα του CD40 ήταν αυξημένα σε πλάσμα, ούρα και κύτταρα των διαβητικών ασθενών και συσχετίζονταν με τη γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη, ενώ παρατηρήθηκε και αυξημένη έκκριση του μορίου στα υπερκείμενα καλλιεργειών μονοπυρήνων του περιφερικού αίματος που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες υπεργλυκαιμίας...