Πειραματική μελέτη ενδονευρικής έγχυσης OX7-saporin επιλεκτικά σε περιφερικούς νευρώνες για την αντιμετώπιση νευρώματος-σε-συνέχεια

Abstract

Aim: To describe a model of neuroma-in-continuity in rats and evaluate the effect of intraneural OX7-saporin immunotoxin conjugate injection on the dorsal root ganglia to inhibit neuroma-in-continuity foramtion. Methods: 54 adult male rats were divided in two groups (control group: 6 animals; experimental groups: 12 subgroups, 48 animals). The left common peroneal, tibial or sciatic nerves were crushed by a 10-second application of a microforceps. At 3 and 6 weeks after nerve crush, the respective nerve was cut distal to the site of nerve crush, and retrograde fluorescent labelling was done. Pressure microinjection of 2 μl natural saline or OX7-saporin was done at the nerve stump two days later. Sacrifice was done at 3 weeks after injection. The harvested nerve specimens of each peripheral nerve were subjected to gross observation and histological sectioning. The effect of OX7-saporin on the dorsal root ganglia was evaluated with direct counting of the labelled neurons using fluorescent microscopy in order to quantify the lesions produced by the OX7-saporin. Statistical analysis was done using the chi-square test. Results: In all specimens from the animals of the control group and the saline-injection experimental subgroups, gross observation showed a thickened area at the site of nerve crush suggesting a typical neuroma-in-continuity. Histology showed entangled, large amount of regenerating, fine-caliber, poorly myelinated axons and a meshwork of thickened connective tissue; the transverse diameter of the neuromas-in-continuity was 2.7 to 3.4 mm. These histological features were consistent with a neuroma-in-continuity. In 19/24 specimens of the OX7-saporin injection experimental subgroups, a narrowed area instead of a thickened neuroma-in-continuity was observed at the site of nerve crush. Histology showed extreme vacuolization and wiping out of almost all nerve fibers, leaving an empty neural tube encasing by connective tissue. The transverse diameter of these lesions was 0.9 to 1.3 mm. These changes occupied almost the total area of the nerve under consideration, and were considered as prevention of neuroma-in-continuity (p= 0.000). Histology of dorsal root ganglia showed non-specific necrosis. Fluorescent microscopy showed reduction of the labelled neurons in the dorsal root ganglia corresponding to the OX7-saporin injection subgroups (p< 0.001). There were no differences between the time from injection (3 or 6 weeks) or the different peripheral nerve specimens (p= 1.000). Conclusion: A 10-second crush with a microforceps produces a neuroma-in-continuity in rats. Intraneural OX7-saporin injection inhibits neuroma-in-continuity formation through selective targeting of the L4-L5 dorsal root ganglia neurons projecting axons at the site of neuroma-in-continuity.

Σκοπός: Ο σχεδιασμός ενός μοντέλου νευρώματος-σε-συνέχεια σε επίμυες και η εκτίμηση της δράσης της νευροανοσοτοξίνης OX7-saporin στους νευρώνες των Ο4-Ο5 ραχιαίων γαγγλίων για την αναστολή του νευρώματος. Μέθοδοι: 54 ενήλικες άρρενες επίμυες χωρίστηκαν σε ομάδα ελέγχου (6 επίμυες) και πειραματικές ομάδες (12 ομάδες, 48 επίμυες,). Στην ομάδα ελέγχου ελέγχθηκε ο σχηματισμός νευρώματος-σε-συνέχεια και η ιστοπαθολογία των Ο4-Ο5 ραχιαίων γαγγλίων στο μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού. Στις πειραματικές ομάδες ελέγχθηκε η δράση της OX7-saporin συγκριτικά με θεραπεία ελέγχου (φυσιολογικό ορό). Σε κάθε πειραματόζωο, έγινε σύνθλιψη με μία ευθεία μικρολαβίδα στην πρώτη ασφάλεια για 10 δευτερόλεπτα του αριστερού ισχιακού, κνημιαίου ή κοινού περονιαίου νεύρου. Στις 3 ή 6 εβδομάδες μετά τη σύνθλιψη, τα αντίστοιχα νεύρα τέμνονταν περιφερικά της σύνθλιψης και εμβαπτίζονταν σε διάλυμα φθοριοχρωστικής (Black-Gold: κνημιαίο νεύρο και Fluoro-Ruby: κοινό περονιαίο νεύρο). Δύο ημέρες αργότερα, γινόταν έγχυση 2 μl φυσιολογικού ορού ή OX7-saporin, και 3 εβδομάδες μετά γινόταν ευθανασία και συλλογή των ιστών (εξεταζόμενο νεύρο και Ο4-Ο5 ραχιαία γάγγλια). Για την αξιολόγηση του σχηματισμού νευρώματος-σε-συνέχεια και τη δράση της OX7-saporin, τα παρασκευάσματα των περιφερικών νεύρων υπεβλήθησαν σε μακροσκοπική και ιστολογική εξέταση (διάμετρος της βλάβης-σε-συνέχεια και ιστολογικές μεταβολές). Για την αξιολόγηση της δράσης της ΟΧ7-saporin στα Ο4-Ο5 ραχιαία γάγγλια μετρήθηκε ο αριθμός των σημασμένων νευρώνων στο μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού. Η στατιστική ανάλυση έγινε με το στατιστικό κριτήριο x2. Αποτελέσματα: Σε όλα τα παρασκευάσματα της ομάδας ελέγχου και των υποομάδων έγχυσης φυσιολογικού ορού, μακροσκοπικά διαπιστώθηκε πάχυνση του νεύρου στο σημείο της σύνθλιψης. Ιστολογικά διαπιστώθηκε μεγάλος αριθμός άναρχων και αποδιοργανωμένων, λεπτών, πτωχά εμμύελων νευραξόνων σε δίκτυο πυκνού συνδετικού ιστού. Τα ευρήματα αυτά ήταν συμβατά με νεύρωμα-σε-συνέχεια με μέγιστη εγκάρσια διάμετρο 2.7 έως 3.4 χιλιοστά. Σε 19/24 παρασκευάσματα των υποομάδων έγχυσης OX7-saporin, μακροσκοπικά διαπιστώθηκε λέπτυνση του νεύρου στο σημείο της σύνθλιψης. Η ιστολογική εξέταση έδειξε κενοτοπιώδη εκφύλιση και σχεδόν εξαφάνιση όλων των νευρικών ινών, καταλείποντας ένα κενό ενδονευρικό σωλήνα περιβεβλημένο από συνδετικό ιστό, με μέγιστη εγκάρσια διάμετρος των βλαβών-σε-συνέχεια 0.9 έως 1.3 χιλιοστά. Οι αλλοιώσεις αυτές αφορούσαν ολόκληρη την υπό εξέταση περιοχή του νεύρου και θεωρήθηκαν ως αναστολή ή παρεμπόδιση του σχηματισμού νευρώματος-σε-συνέχεια από τη δράση της OX7-saporin (p= 0.000). Η ιστολογική εξέταση των παρασκευασμάτων των ραχιαίων γαγγλίων έδειξε μη-ειδική νέκρωση. Στο μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού, ο αριθμός των σημασμένων νευρώνων των Ο4-Ο5 ραχιαίων γαγγλίων ήταν σημαντικά μειωμένος στις υποομάδες έγχυσης OX7-saporin συγκριτικά με τις υποομάδες έγχυσης φυσιολογικού ορού (p< 0.001). Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των υποομάδων των διαφορετικών περιφερικών νεύρων ή των ραχιαίων γαγγλίων στις δύο χρονικές περιόδους (3 και 6 εβδομάδες) ενδονευρικής έγχυσης φυσιολογικού ορού ή ΟΧ7-saporin μετά τη σύνθλιψη του περιφερικού νεύρου (p= 1.000). Συμπέρασμα: Η σύνθλιψη με τη μικρολαβίδα για 10 δευτερόλεπτα προκαλεί νεύρωμα-σε-συνέχεια. Η ενδονευρική έγχυση OX7-saporin αναστέλλει το σχηματισμό νευρώματος-σε-συνέχεια με υπερεκλεκτική δράση στους νευρώνες των Ο4-Ο5 ραχιαίων γαγγλίων.